國自然熱點(diǎn)是近幾年國自然申請(qǐng)的風(fēng)向標(biāo)，結(jié)合國自然熱點(diǎn)為課題方向，能有效提高國自然申請(qǐng)的中標(biāo)率。在歷年的國自然資助中，腫瘤免疫基金中標(biāo)數(shù)逐年遞增且增量可觀。眾所周知，腸道微生物是當(dāng)今比較火的科研熱點(diǎn)，相關(guān)的研究成果更是頻頻登上各大頂級(jí)期刊，而且有大量的研究表明腸道微生物對(duì)腫瘤免疫治療具有重要的影響。今天就分享一篇發(fā)表在Science上的一篇文章，希望能為您的選題有所幫助：

近來，許多研究表明一些腸道菌群的存在與ICB療效的提高有關(guān)。為了弄清其中潛在的分子機(jī)制，Kathy D. McCoy團(tuán)隊(duì)篩選并研究了多種能顯著提高ICB療效的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)Bifidobacterium pseudolongum可通過代謝物肌苷（inosine）來增強(qiáng)免疫應(yīng)答。2020年9月，他們的研究結(jié)果發(fā)表在了頂級(jí)學(xué)術(shù)期刊Science上：Microbiome-derived inosine modulates response to checkpoint inhibitor immunotherapy [1]。

研究人員首先在偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）小鼠模型上尋找與ICB療效相關(guān)的菌群；然后在皮下接種了MC38（小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞系）的無菌小鼠模型中篩選可顯著提高ICB療效的腸道菌群（使用無菌小鼠模型可控制菌群種類變量），并研究潛在的分子機(jī)制；最后在多種不同類型的腫瘤小鼠模型上進(jìn)行了驗(yàn)證。

為了探究ICB療法在AOM/DSS誘導(dǎo)的CRC小鼠模型中的有效性，研究人員對(duì)小鼠進(jìn)行CTLA-4抗體和PD-L1抗體處理。結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，使用同等劑量的兩組ICB實(shí)驗(yàn)組中腫瘤的數(shù)量和重量明顯減少、干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞比例降低。研究人員接下來對(duì)小鼠腫瘤進(jìn)行了測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，盡管兩組的糞便菌群總體組成沒有明顯差異，但I(xiàn)CB實(shí)驗(yàn)組的糞便菌群多樣性更高，且一些菌群顯著增多。

由于原位腺癌模型中腸道菌群數(shù)量有限，腫瘤演進(jìn)嚴(yán)重受阻，研究人員決定接下來轉(zhuǎn)為使用皮下異位接種MC38的無菌或SPF級(jí)小鼠模型。利用CRC異位移植模型，研究人員篩選出了3種腸道菌群。單菌移植這些菌群到CRC異位移植無菌小鼠中能顯著提高CTLA4抗體的療效，而其中，B. pseudolongum也能顯著提高PD-1抗體療效。因此，研究人員決定選取B. pseudolongum進(jìn)行接下來的抗腫瘤免疫機(jī)制研究。
 

圖1. 篩選能增強(qiáng)ICB療效的菌群

研究人員發(fā)現(xiàn)只進(jìn)行B. pseudolongum單菌移植而不進(jìn)行ICB處理并不能誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)，這說明抗腫瘤免疫反應(yīng)依賴于ICB的存在。此外，在CRC異位移植小鼠模型中，研究人員并沒有在腫瘤中發(fā)現(xiàn)B. pseudolongum的存在。這些數(shù)據(jù)表明ICB療效的增強(qiáng)并不依賴于腫瘤中B. pseudolongum的存在，可能有可溶性因子參與其中。此外，胃腸道炎癥是CTLA-4抗體療法常見的一種副作用。據(jù)此，研究人員提出假設(shè)：CTLA-4抗體處理導(dǎo)致了腸道屏障完整性受損，腸道通透性增高，進(jìn)而引起了B. pseudolongum代謝物全身系統(tǒng)性易位的增高。為了探究這個(gè)假設(shè)，研究人員收集了CTLA-4抗體處理且B. pseudolongum單菌移植或不移植菌群的MC38荷瘤無菌小鼠的血清，并將這些血清輸入到CTLA-4抗體處理的MC38荷瘤無菌小鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示，只有來源于CTLA-4抗體處理加上B. pseudolongum單菌移植的小鼠血清能顯著抑制荷瘤無菌小鼠體內(nèi)腫瘤的生長。這說明血清中來源于或是由B. pseudolongum誘導(dǎo)產(chǎn)生的可溶性因子是ICB療效增強(qiáng)的原因。根據(jù)血清樣本的非靶向代謝組學(xué)（untargeted metabolomics）、細(xì)菌培養(yǎng)上清液成分分析和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)了B. pseudolongum的代謝物肌苷。
 

圖2. B. pseudolongum和ICB處理對(duì)Th1細(xì)胞表型的影響及促進(jìn)免疫療效的代謝物肌苷的鑒定

特別地，肌苷能與腺苷2A受體（A2AR）結(jié)合。在一些報(bào)道中顯示，它們的結(jié)合在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)Th1分化有抑制作用；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對(duì)抗腫瘤免疫有抑制作用。但也有小部分研究表明肌苷類似物有促炎反應(yīng)，A2AR信號(hào)可以維持Th1在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤免疫作用。基于這些“矛盾”的報(bào)道，研究人員探究發(fā)現(xiàn)，肌苷對(duì)Th1的作用是由環(huán)境決定的：在有外源IFN-γ存在的情況下，肌苷促進(jìn)初始T細(xì)胞分化為Th1；當(dāng)IFN-γ不存在時(shí)，肌苷抑制Th1的分化。接下來，研究人員探究了肌苷促Th1分化的分子機(jī)制。結(jié)果顯示：當(dāng)A2AR信號(hào)被阻斷時(shí)，肌苷的促Th1分化作用失效；加入cAMP（A2AR的下游信號(hào)分子）后，肌苷的促Th1分化作用恢復(fù)；而阻斷蛋白激酶A（cAMP的下游信號(hào)分子）后，肌苷的促Th1分化作用失效。此外，inosine-A2AR-cAMP-PKA信號(hào)通路能導(dǎo)致cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element-binding protein，CREB）的磷酸化，而CREB是已知的Th1關(guān)鍵分化因子（e.g. IL-12R和IFN-γ）的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。隨后，研究人員探究了T細(xì)胞表面A2AR在B. pseudolongum增強(qiáng)ICB療效中的必要性。結(jié)果顯示A2AR的缺失會(huì)降低B. pseudolongum對(duì)ICB療效的增強(qiáng)效果。

為了弄清肌苷是否能在沒有B. pseudolongum的情況下促進(jìn)CTLA-4抗體誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫作用，研究人員對(duì)MC38荷瘤無菌小鼠進(jìn)行肌苷或PBS口服/全身性給藥，并加入CTLA-4抗體和共刺激信號(hào)CpG。與PBS對(duì)照組相比，加入CTLA-4抗體和CpG后，肌苷口服和全身性給藥組的腫瘤重量都出現(xiàn)降低，抗腫瘤免疫作用增強(qiáng)。相反地，在沒有CpG的情況下，肌苷處理組的腫瘤重量上升，抗腫瘤免疫作用下降。這與之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致：肌苷的抗腫瘤免疫作用是由環(huán)境決定的（取決于共刺激信號(hào)的存在與否）。另外，肌苷的抗腫瘤免疫作用也取決于T細(xì)胞上的A2AR：過繼性輸入A2AR缺失的T細(xì)胞到Rag1敲除（無T、B細(xì)胞）的MC38荷瘤無菌小鼠體內(nèi)，小鼠口服肌苷并不能引起抗腫瘤免疫反應(yīng)。這些數(shù)據(jù)說明肌苷介導(dǎo)了B. pseudolongum對(duì)ICB療效的增強(qiáng)效果，且這種效果特異性地取決于T細(xì)胞上的A2AR。
 

圖3. 肌苷促進(jìn)Th1細(xì)胞的活化與抗腫瘤免疫作用

由于在多數(shù)腫瘤免疫反應(yīng)中，Th1一般被認(rèn)為起到抗腫瘤免疫作用，因此研究人員決定在其他腫瘤小鼠模型上驗(yàn)證肌苷聯(lián)合共刺激信號(hào)是否能夠增強(qiáng)ICB療效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：使SPF級(jí)Msh2LoxP/LoxPVillin-Cre小鼠（自發(fā)小腸腺癌）口服肌苷，并給予CTLA-4抗體和CpG共刺激，小鼠體內(nèi)腫瘤重量明顯下降，脾臟內(nèi)IFN-γ+CD4+ 和 IFN-γ+CD8+ T細(xì)胞數(shù)量顯著升高；在膀胱癌和黑色素瘤小鼠模型上也能觀察到類似結(jié)果。
 

圖4. 代謝物肌苷能在小腸癌、膀胱癌和黑色素瘤小鼠模型中增強(qiáng)免疫療法的效用

綜上，研究人員發(fā)現(xiàn)，自ICB處理的小鼠CRC腫瘤上分離出的B. pseudolongum菌群是一種重要的小腸共生菌群，它的代謝物肌苷能顯著增強(qiáng)ICB療法的有效性。而且對(duì)人類糞便菌群宏基因組進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，盡管差異不是非常顯著，但相比于在ICB療法無應(yīng)答患者中，ICB療法應(yīng)答患者中的B. pseudolongum菌群數(shù)量更多；而且在屬水平上，ICB療法應(yīng)答患者中的B. pseudolongum菌群也更豐富：B. longum和B. adolescentis都有明顯富集。這種菌群代謝物介導(dǎo)的免疫途徑可用于研發(fā)CRC或其他癌癥中基于菌群的免疫輔助療法。此外，研究還發(fā)現(xiàn)A2AR對(duì)B. pseudolongum增強(qiáng)ICB療效十分重要，因此在使用A2AR阻斷劑進(jìn)行腫瘤免疫治療的時(shí)候要注意這種做法可能會(huì)消除有益菌群的抗腫瘤作用。

參考文獻(xiàn)：
[1] L. F. Mager et al. Microbiome-derived inosine modulates response to checkpoint inhibitor immunotherapy. Science 10.1126/science.abc3421(2020).