1.單細胞測序
單細胞測序（Single Cell Squencing）：簡稱SCS，是指從單個細胞提取DNA或RNA樣品進行DNA或RNA的測序。該技術自2009年問世，2013年被Nature Methods評為年度技術以來，越來越多地被應用在科研領域。2015年以來，10X Genomics、Drop-seq、Micro-well、Split-seq等技術的出現(xiàn)，大大降低了單細胞測序的成本門檻。目前，單細胞測序技術已廣泛應用在腫瘤異質性研究、干細胞發(fā)育和分化、人類細胞圖譜構建、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、免疫方向、胚胎細胞發(fā)育研究、疾病分型等多方面。

2.單細胞測序的優(yōu)勢
與傳統(tǒng)高通量測序相比，單細胞測序一次檢測量可達100-200Gb，包含1000~6000個不同細胞的基因表達，超高通量可以對6000~10000個單細胞轉錄組分析。它的優(yōu)勢也體現(xiàn)在以下幾點：
①能準確區(qū)分細胞群體，并進行細胞類別間的比較；
②能找到稀有細胞的表達情況；
③準確分析每一個細胞的基因表達；
④能對于微環(huán)境中的細胞間關系進行分析解讀；
⑤從表達量，細胞量，細胞組成等多角度對樣本進行分析。

3.單細胞測序的不同技術
①斯坦福大學Stephen Quak研發(fā)的基于芯片技術的單細胞測序，該技術設計了一種路線，用液體載運細胞通過一連串顯微管道和微閥門，當細胞挨個進入各自的小空位時，它們的DNA就會被提取出來，經(jīng)過復制用于進一步分析。該方法不僅能分離細胞，還能用化學試劑將細胞混合起來，通過檢測反應過程中的熒光發(fā)射獲得它們的基因編碼。所有這些都能在芯片上完成，不僅操作簡單，而且成本效益高。目前應用在研究精子細胞的重組和突變率。
②美國科學院院士謝曉亮教授研發(fā)的多重退火和成環(huán)循環(huán)擴增技術，通過降低PCR擴增偏倚，使得單細胞中93%的基因組能夠被測序。這種方法使得檢測單細胞中較小的DNA序列變異變得更容易，因此能夠發(fā)現(xiàn)個別細胞之間的遺傳差異。這樣的差異可以幫助解釋癌癥惡化的機制，生殖細胞形成機制，甚至是個別神經(jīng)元的差異機制。
③深圳華大基因研究院研發(fā)的基于多重置換擴增（MDA）的單細胞測序，該方法不僅具有更高的分辨率和基因組覆蓋度，而且具有更好的敏感性和特異性。該方法從單核苷酸水平上為各種復雜疾病和生物學過程的研究開辟了新思路。
④加拿大英屬哥倫比亞大學Peter Lansdorp研發(fā)的Strand-seq技術，該方法能分別對單細胞的雙親DNA模板鏈進行測序，獲得高分辨率的姊妹染色體交換圖譜，檢測到基因重排，從而發(fā)現(xiàn)細胞復制過程中DNA序列的翻轉或交換。利用Strand-seq方法，研究人員完成了單鏈DNA測序，并發(fā)現(xiàn)了首個基因組壓力和不穩(wěn)定性的痕跡。

4.單細胞測序的實驗流程
①采集細胞樣品：用酶消化的方法獲取單細胞消化懸液；
②細胞計數(shù)和活性檢測：檢測單細胞懸液中細胞的活性狀態(tài)，并完成細胞計數(shù)，計算上樣量。對細胞質量的要求是：細胞活性大于70%，濃度為500~2000個細胞/ml，上機細胞數(shù)不高于10000個。
③單細胞分離：將單細胞懸液標記特定的barcode，用單細胞捕獲設備捕獲。
④單細胞建庫：通過RNA反轉錄、PCR等步驟獲得可以上機測序的DNA文庫。
⑤上機測序：使用測序平臺對單細胞轉錄文庫進行高通量檢測。
⑥數(shù)據(jù)分析：對測序結果進行分析和解讀。

5. Countstar Rigel 熒光分析儀在單細胞測序中的應用
單細胞測序過程中需要對細胞進行濃度和活率的精確計數(shù)，多數(shù)細胞樣本是從組織中消化下來的，含有更多地細胞碎片和雜質，傳統(tǒng)的計數(shù)方法不能排除這些雜質和碎片的干擾。Countstar Rigel全自動熒光分析儀是一款基于圖像法檢測、配合多熒光通道，通過采集圖像中的細胞信息，進行定量分析。它將熒光顯微成像與統(tǒng)計學群體分析結合于一身，既能提供細胞群的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，又可以獲得單個細胞的圖像，從而提供細胞形態(tài)學信息。它結合AO（丫啶橙）和PI（碘化丙啶）兩種核酸染料，通過熒光染色和圖像識別法對細胞濃度和活率進行精確計數(shù)（如圖1），有效地排除細胞碎片和雜質的干擾（如圖2），并可提供多種導出格式（如圖3），是單細胞測序過程中的好伙伴。