在多色流式中常常會(huì)使用到偶聯(lián)染料。然而由于偶聯(lián)染料的特殊性，在使用上也有特殊要求，今天我們就來聊聊怎么用好偶聯(lián)染料。

 

什么是偶聯(lián)染料？

 

偶聯(lián)染料由兩個(gè)共價(jià)連接的熒光分子組成。這些分子之一是蛋白質(zhì)（即PE，APC）或合成染料（即BV421™），其特征在于消光系數(shù)（吸收能量的能力）大的一方可作為供體，而第二個(gè)分子是作為受體的小型合成染料（即Cyanine5，Cyanine7）。

 

圖1 常見的偶聯(lián)染料分類和特性

 

我們?yōu)槭裁匆�使用偶�?lián)染料？

 

眾所周知，一個(gè)樣本可以同時(shí)使用的熒光素的數(shù)量受到流式細(xì)胞儀上激光器和檢測(cè)器數(shù)量的限制（表1）。當(dāng)前市場(chǎng)上最先進(jìn)的細(xì)胞儀儀器有5種激光器，包括紫外線（355 nm），紫色（405 nm），藍(lán)色（488 nm），綠色（532 nm）或黃綠色（561 nm）和紅色（633 nm） ，并有可能在每個(gè)激光器上集成8個(gè)甚至更多參數(shù)。但是，目前還沒有足夠的光譜不同的熒光素來填充此配置。如果沒有偶聯(lián)熒光素，則每個(gè)激光器僅適合分開激發(fā)少量熒光素，從而嚴(yán)重限制了可檢測(cè)參數(shù)的總額。

 

表1. 不同激光器、檢測(cè)器和儀器下可用的多色流式panel示例（非最新配置信息）。

 

進(jìn)一步擴(kuò)大每個(gè)激光探測(cè)器的數(shù)量，使得多色流式panel可以增加到21種顏色/ 23個(gè)參數(shù)（表1）。也正是因?yàn)榕悸?lián)染料具有激發(fā)供體受體發(fā)射的這種特性，才使得擴(kuò)大多色流式panel可以實(shí)現(xiàn)。因此，盡管供體染料和其tandem被相同的激光激發(fā)，但是通過使用不同的檢測(cè)器讀出它們的發(fā)射光，它們可以在同一panel中使用。舉例來說，圖1展示了BV421™及其偶聯(lián)熒光素的激發(fā)和發(fā)射光譜。

 

假使想更進(jìn)一步擴(kuò)展多色流式panel，可以使用光譜細(xì)胞儀來實(shí)現(xiàn)。該儀器目前最新的參數(shù)是可配置五個(gè)激光器，64個(gè)熒光檢測(cè)通道。以Cytek^® Aurora為例，Cytek成功開發(fā)了一個(gè)40色的免疫分型方案，僅從一根試管中進(jìn)行細(xì)胞獲取，便可獲得具有出色分辨率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。光譜檢測(cè)系統(tǒng)沒有利用傳統(tǒng)的補(bǔ)償計(jì)算方法，而是允許同時(shí)使用具有顯著重疊發(fā)射光譜的熒光團(tuán)（即BV750™和BV785™），無需擔(dān)心補(bǔ)償問題。

 

圖2. BV421™及其偶聯(lián)熒光素BV570™，BV605™，BV650™，BV711™，BV750™，BV785™的激發(fā)和發(fā)射光譜。

 

偶聯(lián)染料如何工作？

 

供體熒光團(tuán)吸收特定波長(zhǎng)的光能，激發(fā)后，能量通過稱為Förster共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的現(xiàn)象（也稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移）從供體轉(zhuǎn)移到受體。受體以熒光的形式發(fā)射轉(zhuǎn)移能量。當(dāng)FRET效率很高時(shí)，將在受體通道中觀察到強(qiáng)信號(hào)，而在供體通道中觀察到弱信號(hào)。請(qǐng)注意，F(xiàn)RET效率永遠(yuǎn)不會(huì)達(dá)到100％，這意味著在供體通道中會(huì)有一些溢出或滲漏。當(dāng)然這取決于偶聯(lián)染料的質(zhì)量。為正確分析，建議使用同型對(duì)照作為背景，單染對(duì)照來適當(dāng)?shù)卣{(diào)整補(bǔ)償，F(xiàn)MO（(Fluorescence-minus-one）對(duì)照來畫門。

 

我在供體通道中看到了熒光信號(hào)。我的偶聯(lián)染料是否降解了？

 

沒有。這是一個(gè)常見的誤解。供體和受體染料共價(jià)結(jié)合，通常供體和受體不會(huì)在溶液中分開，不會(huì)降解。如前所述，由于FRET效率不是100％，因此在預(yù)期中便有熒光溢出或滲入供體通道。為了準(zhǔn)確地補(bǔ)償溢出，重要的是使用與多色樣品相同的抗體作為單色補(bǔ)償對(duì)照，并與多色樣品一樣去處理它們，尤其是在一樣的光照和固定條件下。但是，如果在供體通道中觀察到強(qiáng)信號(hào)，在受體通道中觀察到弱信號(hào)，則表明FRET效率低，可能是由以下因素引起的：

• 光漂白。所以需要始終保護(hù)偶聯(lián)染料免受光或其他氧化應(yīng)激源的影響，因?yàn)樗鼈儤O易受到氧化引起的光漂白。這種情況下會(huì)導(dǎo)致偶聯(lián)功能喪失，并且不可逆。

• 暴露在冷凍溫度下。不要冷凍偶聯(lián)熒光抗體，它可能導(dǎo)致基于蛋白質(zhì)的供體熒光團(tuán)變性。

• 固定和通透性。不要長(zhǎng)時(shí)間將細(xì)胞置于固定液中，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致自發(fā)熒光增加，并對(duì)偶聯(lián)造成成更大的傷害。強(qiáng)烈建議固定后清洗細(xì)胞，并用FluoroFix™緩沖液（Cat#422101）替換普通緩沖液。雖然固定后也可以進(jìn)行表面染色，但是，請(qǐng)務(wù)必查看我們的“fixation”頁(yè)面（https://biolegend.com/fixation）以了解我們的抗體克隆與固定液的兼容。

 

不同固定劑會(huì)如何影響偶聯(lián)染料熒光信號(hào)？這里有個(gè)例子，圖2展示了用PerCP/Cyanine5.5-偶聯(lián)抗體染色細(xì)胞并暴露于1％PFA或True-Phos™ Perm緩沖液（Cat#425401）中，再來看細(xì)胞的熒光信號(hào)。由于PerCP偶聯(lián)熒光是一種基于蛋白質(zhì)的染料，所以當(dāng)它暴露于基于甲醇的True-Phos™ Perm緩沖液中會(huì)導(dǎo)致PerCP變性，以致PerCP信號(hào)丟失，但不會(huì)導(dǎo)致其受體Cyanine5.5失去信號(hào)，該受體的熒光可以在AlexaFluor^® 700通道中檢測(cè)到。

 

圖3. A 暴露于1％PFA或True-Phos™ Perm緩沖溶液中時(shí)，PerCP/Cyanine5.5抗CD14抗體染色的熒光強(qiáng)度。B點(diǎn)圖，表明將PerCP/Cyanine5.5暴露于True-Phos™ Perm緩沖液后，AlexaFluor^®700通道中出現(xiàn)的信號(hào)。

 

成功使用偶聯(lián)熒光抗體的小秘訣

 

• 避免長(zhǎng)時(shí)間暴露在強(qiáng)光線下，以及減少溫度劇烈變化。光線會(huì)使偶聯(lián)熒光光漂白，始終保護(hù)樣品和抗體免受光照。不要冷凍偶聯(lián)熒光抗體，因?yàn)檫@可能導(dǎo)致供體蛋白變性。

• 避免“過分固定”。我們建議在短時(shí)間內(nèi)（不到30分鐘）固定偶聯(lián)熒光，然后將其清洗并重懸在Cell Staining緩沖液中進(jìn)行保存。為此，我們提供了專門配制的FluoroFix™緩沖液（Cat#422101），用于固定偶聯(lián)染料。

• 對(duì)帶有偶聯(lián)熒光的多色流式實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，請(qǐng)注意受體分子的跨激發(fā)光激發(fā)。在大多數(shù)情況下，可以通過補(bǔ)償來分析。例如，已知PE/Cyanine5中的Cyanine5受體可被紅色激光激發(fā)，因此與APC結(jié)合使用時(shí)要格外小心。

• 在4°C或冰上標(biāo)記細(xì)胞。APC偶聯(lián)熒光可能容易受細(xì)胞介導(dǎo)的去偶聯(lián)作用，因此在低溫下減慢細(xì)胞新陳代謝可以幫助保持偶聯(lián)的穩(wěn)定性。

• 為避免基于Cynanine的染料（即PE/Cyanine7，APC/Cyanine7）與單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞非特異性結(jié)合，我們建議使用True-Stain Monocyte Blocker™（Cat# 426103）。