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從新冠疫情看分子診斷POCT的發(fā)展

瀏覽次數(shù):3622 發(fā)布日期:2020-7-10  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責任自負

     疾病檢測技術(shù)一直處于高速發(fā)展的過程中,越來越多的手段使人類對疾病的診斷日漸精準。但是,準確率更高的檢測手段通常意味著更高的成本、更長的時間、更繁復(fù)且條件苛刻的診斷流程,這使得臨床往往在面對高度傳染性疾病時陷入兩難的境地,即大規(guī)模確診病人的緊迫性與捉襟見肘的高端檢測資源相沖突。

在此次新冠疫情面前,常見檢測手段的局限性就暴露無遺,由于診斷“金標準”分子診斷對試劑、設(shè)備、場地、操作人員要求都很高,檢測集中在三級以上醫(yī)院及各大三方檢測中心中,資源非常有限,最終在檢測能力不足以快速識別所有患者的情況下,為切斷傳染鏈只能對所有人采取停工、停學等手段,極大的影響到日常經(jīng)濟活動和生活。

同樣的,世界醫(yī)學最發(fā)達的日本、美國等國家地區(qū)也無法擺脫檢測試劑不足、檢測成本高昂等問題。如果能有兼顧高準確率、低成本、操作簡易、用時短等特點,適合基層醫(yī)療機構(gòu)使用的檢測手段,無疑將大大提高防疫效率。

實際上,分子診斷方法不僅僅在提高準確度、通量等方向進步,也在努力朝著小型化、自動化、高速化、簡易化等方向發(fā)展,推動分子診斷實現(xiàn)去中心化的目的,普惠基層醫(yī)療。在這其中,得益于恒溫擴增新技術(shù)的使用,已經(jīng)誕生了一批符合基層條件的分子診斷POCT產(chǎn)品,包括此次疫情中也催生了不少相關(guān)產(chǎn)品,值得我們深入探討和研究。
 

01、分子診斷的必要性  

傳染性疾病的診斷方法有培養(yǎng)法、免疫檢驗、分子檢驗、質(zhì)譜檢驗等,綜合效率、成本、準確率、使用難度等各方面因素考量,免疫檢測和分子檢測是當前最為主要的兩種診斷方法。

此次新冠肺炎的診斷也以分子診斷和免疫檢測為標準。根據(jù)《新冠病毒感染的肺炎診療方案(試行第七版)》(“診療方案”),新冠肺炎患者有3種確診方法:“1. 實時熒光RT-PCR檢測新型冠狀病毒核酸陽性;2. 病毒基因測序,與已知的新型冠狀病毒高度同源;3. 血清新型冠狀病毒特異性IgM抗體和IgG抗體陽性;血清新型冠狀病毒特異性IgG抗體由隱性轉(zhuǎn)為陽性或恢復(fù)期較急性期4倍及以上升高”。

其中前2種方法為分子診斷,第3種為免疫檢驗。值得注意的是,第3種檢測方法是在最新一版診療方案中才被加入,分子診斷的權(quán)威性則是在一開始就被確立。

免疫診斷雖然有成本低、操作難度低、檢測速度快等優(yōu)勢,天然適合普及基層使用,但其對檢測有明顯的窗口期要求,必須在患者產(chǎn)生抗體后才能有效,這又與傳染病確診的緊迫性相矛盾。

大部分傳染病在發(fā)病初期的傳染性最強,但免疫診斷在此時又難以確診,容易錯失防疫的重要時機。

相比之下,分子診斷雖然成本高、操作要求高,但窗口期要求遠遠低于免疫檢驗,在面臨重大傳染性疾病時,及時性和準確率才是最重要的考慮因素,并沒有其他更好的選擇。

分子診斷又可被分為核酸擴增技術(shù)、基因芯片、基因測序等多類技術(shù),其中以聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)為主的核酸擴增技術(shù)由于敏感性、特異性表現(xiàn)優(yōu)秀,操作相對簡單且成本低,性價比最高,成為當前最普及的核酸診斷方法。而基因芯片、基因測序則由于技術(shù)難度大、設(shè)備投入大、試劑成本過高等原因,當前還不具備大規(guī)模使用的基礎(chǔ)。在此次疫情中,實時熒光PCR技術(shù)就成為使用量最大的診斷方法。
 

02、PCR的局限性有突破空間  

雖然實時熒光PCR技術(shù)成為此次疫情中最為主要的確診手段,但其本身具有的局限性也在阻礙著檢驗產(chǎn)能的提高,造成疫情初始時檢驗資源嚴重不足的局面。

首先,PCR操作流程繁瑣,導(dǎo)致檢驗效率低且用時過長。簡單而言,PCR需要通過反復(fù)升降溫,循環(huán)“加溫-退火-延伸”步驟進行擴增。擴增通常需要1-2個小時的時間,加上前期樣本處理、提取的流程,總體操作時間往往要超過3個小時,效率低下。并且,上述繁瑣的流程也使得PCR檢驗對操作人員要求較高,基層并無足夠數(shù)量的相關(guān)人員配備。

其次,PCR對操作場地有嚴格要求。由于PCR反應(yīng)過程中不斷進行升溫、降溫,樣本液體蒸發(fā)后冷凝,容易在空氣中形成攜帶大量樣本DNA的氣溶膠,進而污染其他樣品。因此,PCR檢驗需要專門的PCR實驗室,將試劑配制、標本處理、擴增和分析等操作流程區(qū)分開,并通過控制空氣流動方向以保證空氣清潔度。一個PCR實驗室往往需要數(shù)百萬元的資金投入,這是基層無法負擔的,因此我國PCR檢測主要集中在三級以上醫(yī)院和三方大型檢測中心中。

從問題出發(fā),要解決核酸檢驗難以在基層普及的問題,簡化操作流程、實現(xiàn)操作的全自動化、設(shè)備的全集成化勢在必行?上驳氖牵銣財U增新技術(shù)的使用,使突破這些局限因素成為可能性。

恒溫擴增是一種建立在PCR基礎(chǔ)上開發(fā)的核酸擴增手段。通過加入特殊設(shè)計的酶和引物,恒溫擴增無需反復(fù)升降溫,只需要一個溫度即可完成擴增。相比PCR,恒溫擴增不僅僅是操作步驟更簡單,其對儀器設(shè)備的要求很低,反應(yīng)速度被大大縮短至1小時以內(nèi)。從20世紀90年代恒溫擴增技術(shù)被提出后,截止當前全世界共有十多種常見的恒溫擴增技術(shù),包括環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法(LAMP)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增技術(shù)(TMA)、酶促重組等溫擴增法(ERA)等,其原理也不盡相同。

通過恒溫擴增技術(shù)的應(yīng)用,使分子診斷POCT產(chǎn)品成為可能。一方面,擴增的流程被簡化。由于技術(shù)原理限制,PCR的升降溫固有流程難以改變,但是,無需熱變的恒溫擴增技術(shù)只需要一個溫度即可完成擴增反應(yīng),大大縮短檢驗時間。另一方面,全自動化、全集成的檢驗操作正在被逐步實現(xiàn)。通過集成樣本處理、核酸提取、擴增、檢測所有步驟,再加上全自動化的操作體驗,不僅僅使得操作流程更加簡易,還能摒除人為因素的干擾,提升結(jié)果準確率,好處顯而易見。

但是,在生化、免疫等其他各類檢測手段都已經(jīng)實現(xiàn)全自動化的今天,核酸檢驗還遲遲未能實現(xiàn)全自動化,最主要的原因是核酸檢驗靈敏度過高,要求各模塊密閉,對設(shè)備的設(shè)計要求很高;同時PCR又需要反復(fù)升降溫,嚴苛的溫度環(huán)境對本就精密性要求極高的設(shè)備進一步提出挑戰(zhàn),因此全自動PCR產(chǎn)品開發(fā)難度極高。

恒溫擴增技術(shù)的發(fā)展在一定程度上削弱了上述要求的影響。恒溫擴增技術(shù)不需要升降溫環(huán)節(jié),各個反應(yīng)模塊實現(xiàn)封閉化,即解決了交叉污染的問題,又使得流程更為簡單,同時對反應(yīng)條件和設(shè)備要求也都有所降低。
 

03、恒溫擴增應(yīng)是核酸POCT檢測的新方向  

對于疫情的防控,抗體檢測更適用于大量疑似病例和無癥狀感染者的檢測,感染者通常在感染1-2周后,才能在抗體檢測中呈陽性結(jié)果,因此,單獨抗體檢測不能作為確診或排除感染的依據(jù)。核酸檢測較血清抗體檢測的優(yōu)勢在于縮短了感染檢出窗口期,可及早發(fā)現(xiàn)感染者,是目前確診感染的首選方法,也是“金標準”,通過大范圍的核酸檢測更能保證疫情的有效控制。

POCT是指在采樣現(xiàn)場進行的、利用便攜式分析儀器及配套試劑快速得到檢測結(jié)果的一種檢測方式。POCT是檢驗醫(yī)學發(fā)展的重要領(lǐng)域,具有快速檢測、現(xiàn)場采樣、操作簡便的優(yōu)點。

通過恒溫擴增分子POCT的方式,核酸檢測打破了只能在PCR實驗室做的局限,將應(yīng)用場景拓展到出入境、機場、火車站、基層醫(yī)療單位等,從而代替一部分免疫檢測的市場空間。一方面是各種不需要復(fù)雜的熱循環(huán)設(shè)備的等溫擴增技術(shù)逐步代替PCR技術(shù)成為擴增手段;另一方面代替了傳統(tǒng)的核酸提取和加樣配液等復(fù)雜耗時的人工操作,而大大縮短了檢測時間,降低了操作門檻。

3月底時,美國媒體報道了雅培公司利用等溫擴增技術(shù),研發(fā)出了號稱目前檢測速度最快的新冠病毒核酸檢測產(chǎn)品。陽性結(jié)果最快可在5分鐘 內(nèi)獲得,陰性結(jié)果可在13分鐘 內(nèi)確認,在國際上引起了巨大轟動,甚至連美國總統(tǒng)特朗普和FDA局長都為其“直播帶貨”,一時間名聲雀起,就連普通民眾都在談?wù)摗?/span>

我國在這一領(lǐng)域雖然起步稍晚,但也已經(jīng)引起足夠的重視,在恒溫擴增技術(shù)中,酶促重組等溫擴增技術(shù)(ERA技術(shù)),它具有低溫適應(yīng)性,而且在反應(yīng)速度、靈敏度、準確性等方面有了極大的突破。該技術(shù)在低溫條件下(25-42℃)可對極微量的病原體的基因片段進行特異性的快速擴增,10-15分鐘可將目標基因片段精準復(fù)制數(shù)十億倍,只需20 min,就能完成現(xiàn)場檢測并出具報告,極大縮短了檢測時間。目前也已成功研制出“新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒(RT-ERA熒光檢測法)”。

這些企業(yè)和產(chǎn)品的成功,預(yù)示著核酸檢測在我國會隨著此次疫情的顛覆性效應(yīng)迅速擴大市場影響力,而其中能夠適應(yīng)現(xiàn)場檢測的POCT產(chǎn)品會獲得更好的增長空間。

 

04、總結(jié)  

在各項檢驗技術(shù)中,分子診斷有著其他檢驗手段難以比擬的高敏感性和特異性,更憑借幾乎無窗口期限制的優(yōu)勢,成為急性傳染病檢驗的“金標準”。但是分子診斷一直以來是“高大上”的代言詞,由于種種技術(shù)局限性,造成基層難以普及,也無法在大規(guī)模疫情發(fā)展下發(fā)揮應(yīng)有的作用。

所幸,得益于恒溫擴增等各項新技術(shù)的發(fā)展并和分子診斷技術(shù)融合,普惠化的分子診斷產(chǎn)品逐步成為可能。我們也欣喜的看到,雖然分子診斷POCT行業(yè)仍然處于萌芽期當中,但此次抗疫并不缺乏分子診斷POCT產(chǎn)品的身影。

此次面對新冠疫情檢測資源嚴重不足的局面足以為我們敲響警鐘,分子診斷POCT產(chǎn)品值得更多的扶持和鼓勵,我們未來需要更好的武器去抗擊傳染病。

來源:蘇州先達基因科技有限公司
聯(lián)系電話:0512-68439557
E-mail:sales@gendx.cn

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