液滴微流控（四）：在液滴中培養(yǎng)大腸桿菌
已有研究表明，使用氟化油進行油包水液滴制備，可用于長期細胞培養(yǎng)[1]，相較礦物油，氟化油表現出更好的生物相容性[2]，但要找到一種有效穩(wěn)定液滴的表面活性劑，仍是一個挑戰(zhàn)。本研究的目的是：通過在液滴中培養(yǎng)大腸桿菌（Escherichia coli），說明新型表面活性劑dSURF的生物相容性及液滴穩(wěn)定表現。
此研究由Dr Oksana Shvydkiv在其實驗室（Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology. （超鏈接https://www.leibniz-hki.de/en/institut.html））完成。
材料及設備
2.分散相試劑：500μl OD600值為0.005（5 x 106 CFU/ml）或0.01（10 x 107 CFU/ml）的大腸桿菌懸浮液ECJW922。（CFU，colony forming unit，菌落形成單位；OD，Optical Density，光密度）
3.液滴制備解決方案：液滴PDMS芯片由研究者自行設計，液滴制備解決方案為Fluigent所提供的液滴制備系統(tǒng)（見下圖），主要部件包含壓力泵FLOW EZ（壓力泵流量控制穩(wěn)定）、流量傳感器。
實驗過程簡述：壓力泵FLOW EZ將試劑泵至液滴芯片，以生成液滴；PC端AIO軟件監(jiān)測并控制流量，以達到合適的液滴大小及生成頻率。
液滴監(jiān)測
為監(jiān)測液滴的穩(wěn)定性并觀察大腸桿菌的生長狀況，將液滴轉移至微流控芯片觀察室，于倒置顯微鏡（Axio Observer Z1, Zeiss)上進行觀察，所用物鏡放大倍數為10倍，使用PCO相機在開始培養(yǎng)的2小時，4小時和20小時后進行圖像采集。
培養(yǎng)結果
使用OD600=0.005大腸桿菌懸浮液，0.5% dSURF表面活性劑，在37℃溫度下的培養(yǎng)結果：
（A）培養(yǎng)4h后的明場液滴圖像；（B）培養(yǎng)20h后的明場液滴圖像
（C）培養(yǎng)4h后的暗視液滴圖像；（D）培養(yǎng)20h后的暗視液滴圖像
觀察上圖，可明顯觀察到穩(wěn)定的單分散液滴，含大腸桿菌的液滴數量占比為46±0.8 %，理論計算值為54%（液滴尺寸為67.3μm，160pL）。它們之間的差異可以解釋為實驗過程中出現的一些小誤差，如吸取試劑不精確。
使用OD600=0.01大腸桿菌懸浮液，0.5% dSURF表面活性劑，在37℃溫度下的培養(yǎng)結果：
（A）培養(yǎng)4h后的明場液滴圖像；（B）培養(yǎng)20h后的明場液滴圖像
（C）培養(yǎng)4h后的暗視液滴圖像；（D）培養(yǎng)20h后的暗視液滴圖像
于上圖可明顯觀察到穩(wěn)定的單分散液滴，含大腸桿菌的液滴數量占比為89±1 %，理論計算值為86%（液滴尺寸為72.4μm，200pL）。
使用OD600=0.005大腸桿菌懸浮液，3% dSURF表面活性劑，在28℃溫度下的培養(yǎng)結果：
（A）培養(yǎng)4h后的明場液滴圖像；（B）培養(yǎng)20h后的明場液滴圖像
（C）培養(yǎng)4h后的暗視液滴圖像；（D）培養(yǎng)20h后的暗視液滴圖像
由上圖可明顯觀察到穩(wěn)定的單分散液滴，含大腸桿菌的液滴數量占比為63±1.1 %，理論計算值為63%（液滴尺寸為72.4μm，200pL）。
結論
根據上述觀察到的大腸桿菌培養(yǎng)結果，表明dSURF表面活性劑在濃度為0.5%至3%的情況下具有良好的生物相容性，對于常規(guī)應用，使用0.5%濃度的dSURF即可，成本較3%濃度dSURF更低。在大腸桿菌培養(yǎng)20小時后，液滴表現出的良好的穩(wěn)定性，表明dSURF表面活性劑可用于長時間液滴實驗。
參考文獻：
[1]. C. H. J. Schmitz, A. C. Rowat, S. Koester and D. A. Weitz, Dropspots: a picoliter array in a microfluidic device, Lab Chip, 2009, 9, 44–49.
[2]. Lee JN, Park C, Whitesides GM. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Anal Chem 2003, 75:6544-54.
此研究由Dr Oksana Shvydkiv在其實驗室（Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology. （超鏈接https://www.leibniz-hki.de/en/institut.html））完成。
材料及設備
- 連續(xù)相試劑：含0.5%或3%的dSURF（Fluigent）氟化液Novec HFE-7500（Sigma Aldrich）。
2.分散相試劑：500μl OD600值為0.005（5 x 106 CFU/ml）或0.01（10 x 107 CFU/ml）的大腸桿菌懸浮液ECJW922。（CFU，colony forming unit，菌落形成單位；OD，Optical Density，光密度）3.液滴制備解決方案：液滴PDMS芯片由研究者自行設計，液滴制備解決方案為Fluigent所提供的液滴制備系統(tǒng)（見下圖），主要部件包含壓力泵FLOW EZ（壓力泵流量控制穩(wěn)定）、流量傳感器。
實驗過程簡述：壓力泵FLOW EZ將試劑泵至液滴芯片，以生成液滴；PC端AIO軟件監(jiān)測并控制流量，以達到合適的液滴大小及生成頻率。液滴監(jiān)測
為監(jiān)測液滴的穩(wěn)定性并觀察大腸桿菌的生長狀況，將液滴轉移至微流控芯片觀察室，于倒置顯微鏡（Axio Observer Z1, Zeiss)上進行觀察，所用物鏡放大倍數為10倍，使用PCO相機在開始培養(yǎng)的2小時，4小時和20小時后進行圖像采集。
培養(yǎng)結果
使用OD600=0.005大腸桿菌懸浮液，0.5% dSURF表面活性劑，在37℃溫度下的培養(yǎng)結果：
（A）培養(yǎng)4h后的明場液滴圖像；（B）培養(yǎng)20h后的明場液滴圖像
（C）培養(yǎng)4h后的暗視液滴圖像；（D）培養(yǎng)20h后的暗視液滴圖像
觀察上圖，可明顯觀察到穩(wěn)定的單分散液滴，含大腸桿菌的液滴數量占比為46±0.8 %，理論計算值為54%（液滴尺寸為67.3μm，160pL）。它們之間的差異可以解釋為實驗過程中出現的一些小誤差，如吸取試劑不精確。
使用OD600=0.01大腸桿菌懸浮液，0.5% dSURF表面活性劑，在37℃溫度下的培養(yǎng)結果：
（A）培養(yǎng)4h后的明場液滴圖像；（B）培養(yǎng)20h后的明場液滴圖像（C）培養(yǎng)4h后的暗視液滴圖像；（D）培養(yǎng)20h后的暗視液滴圖像
于上圖可明顯觀察到穩(wěn)定的單分散液滴，含大腸桿菌的液滴數量占比為89±1 %，理論計算值為86%（液滴尺寸為72.4μm，200pL）。
使用OD600=0.005大腸桿菌懸浮液，3% dSURF表面活性劑，在28℃溫度下的培養(yǎng)結果：
（A）培養(yǎng)4h后的明場液滴圖像；（B）培養(yǎng)20h后的明場液滴圖像
（C）培養(yǎng)4h后的暗視液滴圖像；（D）培養(yǎng)20h后的暗視液滴圖像
由上圖可明顯觀察到穩(wěn)定的單分散液滴，含大腸桿菌的液滴數量占比為63±1.1 %，理論計算值為63%（液滴尺寸為72.4μm，200pL）。
結論
根據上述觀察到的大腸桿菌培養(yǎng)結果，表明dSURF表面活性劑在濃度為0.5%至3%的情況下具有良好的生物相容性，對于常規(guī)應用，使用0.5%濃度的dSURF即可，成本較3%濃度dSURF更低。在大腸桿菌培養(yǎng)20小時后，液滴表現出的良好的穩(wěn)定性，表明dSURF表面活性劑可用于長時間液滴實驗。
參考文獻：
[1]. C. H. J. Schmitz, A. C. Rowat, S. Koester and D. A. Weitz, Dropspots: a picoliter array in a microfluidic device, Lab Chip, 2009, 9, 44–49.
[2]. Lee JN, Park C, Whitesides GM. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Anal Chem 2003, 75:6544-54.
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