今天百螢給大家系統(tǒng)的介紹一下AAT Bioquest的鈣離子熒光探針。AAT Bioquest研發(fā)的鈣離子探針與其他市售的鈣離子熒光探針的區(qū)別是什么？有什么優(yōu)勢(shì)？以及探針的更新及發(fā)展歷程等。感興趣的朋友一起看看吧！

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鈣離子指示劑的發(fā)展歷程

產(chǎn)品名稱	研發(fā)時(shí)間	研發(fā)公司	產(chǎn)品特點(diǎn)	圖示
Fluo-3	1987	Roger Tsien	第一款鈣離子熒光探針	圖1.各類熒光探針熒光強(qiáng)度對(duì)比圖   圖2.鈣離子熒光探針在細(xì)胞內(nèi)的工作原理
Fluo-4	1996	ThermoFisher	比Fluo-3的熒光更亮
Fluo-8	2008	AAT Bioquest	與Fluo-4相比： 1.擁有更亮的熒光 2.易于細(xì)胞加載
Cal-520	2014	AAT Bioquest	與Fluo-4相比： 1.擁有更長(zhǎng)的細(xì)胞內(nèi)保留時(shí)間 2.更高的信噪比
Calbryte-520	2017	AAT Bioquest	與其他產(chǎn)品相比： 1.它擁有最亮的熒光 2.它擁有最長(zhǎng)的細(xì)胞內(nèi)保留時(shí)間 3.更高的信噪比 4.更容易加載

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Fluo-8

在Fluo-8的研發(fā)之前，F(xiàn)luo-3、Fluo-4已廣泛用于流式細(xì)胞術(shù)和酶標(biāo)儀（如：FLIPR）上的鈣離子檢測(cè)，但是，弱熒光信號(hào)和苛刻的染料上樣條件限制了它們?cè)谀承┘?xì)胞分析中的應(yīng)用。而Fluo-8的研發(fā)正好解決了Fluo-3和Fluo-4的這些局限性。

Fluo-3和Fluo-4在細(xì)胞應(yīng)用中最重要的性質(zhì)是它們的吸收光譜與氬離子激光源488nm處的激發(fā)兼容，并且響應(yīng)于Ca²⁺結(jié)合，熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)。我們的Fluo-8 鈣離子檢測(cè)試劑保留了這兩個(gè)優(yōu)秀的特性。Fluo-8試劑的吸收和發(fā)射峰分別為490nm和514nm。在488nm的氬離子激光作用下，它們能得到很好的激發(fā)，其發(fā)射熒光（514nm）隨Ca²⁺濃度的增加而增加。Fluo-8與Ca²⁺結(jié)合后熒光強(qiáng)度增加200倍以上。由于刺激后許多細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺的增加幅度通常是5-10倍，因此Fluo-8是Fluo-3和Fluo-4的卓越替代品。Fluo-8的Kd估計(jì)為389nm（22°C，pH7.0–7.5），但該值可能受到pH、粘度和體內(nèi)結(jié)合蛋白的影響。

表1.Fluo-8鈣離子檢測(cè)試劑的光譜和Ca²⁺結(jié)合特性

Ca2+ 熒光探針	激發(fā)（Ex）	發(fā)射（Em）	Ca2+結(jié)合的Kd
Fluo-8	490 nm	514 nm	389 nM
Fluo-8H	490 nm	514 nm	232 nM
Fluo-8L	490 nm	514 nm	1.86 uM

Fluo-8產(chǎn)品特點(diǎn)：

• 方便檢測(cè)的波長(zhǎng):最大激發(fā)490 nm；最大發(fā)射514 nm。
• 熒光強(qiáng)度高：比Fluo-4 AM高2倍；比Fluo-3 AM高4倍。
• 更快的加載:在室溫下（而不是Fluo-4 AM所需的37ºC）加載染料。
• 多功能Ca²⁺結(jié)合K_d如表1所示。

圖3.將U2OS細(xì)胞以40000細(xì)胞/100ul/孔在96孔板中培養(yǎng)過(guò)夜。去掉生長(zhǎng)培養(yǎng)基，將細(xì)胞分別與100ul的Fluo-3 AM、Fluo-4 AM和Fluo-8AM在HHBS中以4 uM的濃度在37°C、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)。用200ulHHBS洗滌細(xì)胞兩次，然后使用FITC通道用熒光顯微鏡（Olympus IX71）成像。

Fluo-8相關(guān)產(chǎn)品：

貨號(hào)	產(chǎn)品名稱	規(guī)格
21080	Fluo-8，AM *可滲透細(xì)胞*	1mg
21081	Fluo-8，AM *可滲透細(xì)胞*	5x50ug
21082	Fluo-8，AM *可滲透細(xì)胞*	10x50ug
21083	Fluo-8，AM *可滲透細(xì)胞*	20x50ug
21086	Fluo-8，鈉鹽	1mg
21087	Fluo-8，鉀鹽	1mg
21088	Fluo-8，鈉鹽	10x50ug
21089	Fluo-8，鉀鹽	10x50ug
21090	Fluo-8H，AM *可滲透細(xì)胞*	1mg
21091	Fluo-8H，AM *可滲透細(xì)胞*	10x50ug
21095	Fluo-8H，鈉鹽	10x50ug
21096	Fluo-8L，AM *可滲透細(xì)胞*	1mg
21097	Fluo-8L，AM *可滲透細(xì)胞*	10x50ug
21098	Fluo-8L，鈉鹽	10x50ug
21099	Fluo-8L，鈉鹽	1mg
21100	Fluo-8L，鉀鹽	10x50ug
21101	Fluo-8L，鉀鹽	1mg
21102	Fluo-8FF，鉀鹽	10x50ug
21103	Fluo-8FF，鉀鹽	1mg
21104	Fluo-8FF，AM	10x50ug
21105	Fluo-8FF，AM	1mg
36307	Screen Quest Fluo-8 NW鈣含量測(cè)定試劑盒*去除培養(yǎng)基*	1Plate
36308	Screen Quest Fluo-8 NW鈣含量測(cè)定試劑盒*去除培養(yǎng)基*	10Plate
36309	Screen Quest Fluo-8 NW鈣含量測(cè)定試劑盒*去除培養(yǎng)基*	100Plate
36314	Screen Quest Fluo-8 NW鈣含量測(cè)定試劑盒* 1％FBS生長(zhǎng)培養(yǎng)基*	1Plate
36315	Screen Quest Fluo-8 NW鈣含量測(cè)定試劑盒* 1％FBS生長(zhǎng)培養(yǎng)基*	10Plate
36316	Screen Quest Fluo-8 NW鈣含量測(cè)定試劑盒* 1％FBS生長(zhǎng)培養(yǎng)基*	100Plate

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Cal-520、Cal-590、Cal-630

Cal-520，Cal-590和Cal-630提供了最強(qiáng)大的基于均相熒光的檢測(cè)工具，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員。它們是熒光鈣敏感染料，與現(xiàn)有的鈣指示劑（如Fluo-3 AM，F(xiàn)luo-4 AM和Rhod-2 AM）相比，具有明顯改善的信噪比和細(xì)胞內(nèi)滯留性。一旦進(jìn)入細(xì)胞，Cal520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM的親脂性基團(tuán)就會(huì)被細(xì)胞內(nèi)酯酶裂解，從而產(chǎn)生帶負(fù)電荷的熒光染料，并留在細(xì)胞內(nèi)部。與鈣離子結(jié)合后，它們的熒光大大增強(qiáng)。當(dāng)細(xì)胞被激動(dòng)劑刺激時(shí)，該受體會(huì)發(fā)出細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的信號(hào)，從而增加Cal-520，Cal-590或Cal-630的熒光。 Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM的高靈敏度超過(guò)100倍的熒光增強(qiáng)特性使其成為測(cè)量細(xì)胞鈣的理想指標(biāo)。高信噪比和更好的細(xì)胞內(nèi)保留能力使Cal-520，Cal-590或Cal-630鈣測(cè)定成為評(píng)估GPCR和鈣通道靶標(biāo)以及篩選其激動(dòng)劑和拮抗劑的強(qiáng)大工具。

表2.Cal-520，Cal-590或Cal-630 Ca²⁺檢測(cè)試劑的光譜和Ca²⁺結(jié)合特性

Ca2+ 熒光探針	激發(fā)（Ex）	發(fā)射（Em）	Kd (nM)
Cal-520	492 nm	514 nm	320
Cal-590	558 nm	584 nm	561
Cal-630	607 nm	623 nm	792

 

圖4.不含丙磺舒的CHO-M1細(xì)胞中內(nèi)源性P2Y受體對(duì)ATP的反應(yīng)。 將CHO-M1細(xì)胞以每100 µL 40,000個(gè)細(xì)胞的孔接種在黑色96孔板中過(guò)夜。 將HHBS中的100 µl 4 µM Fluo-3 AM，F(xiàn)luo-4 AM或Cal520 AM加入孔中，并將細(xì)胞在37°C下孵育2小時(shí)。 將染料加載介質(zhì)替換為100 µl HHBS，添加50 µl 300 µM ATP，然后使用FITC通道在熒光顯微鏡（Olympus IX71）上成像。

 

圖5.用Cal-520或Fluo-4 AM測(cè)量的CHO-K1細(xì)胞中內(nèi)源性P2Y受體的ATP刺激鈣反應(yīng)。 將CHO-K1細(xì)胞以每100 µL每孔50,000個(gè)細(xì)胞在黑色96孔板上接種過(guò)夜。 將100 µL 5 µM Fluo-4 AM和帶有（A）或不帶有（B）2.5 mM丙磺舒的Cal-520AM加入細(xì)胞中，并將細(xì)胞在37℃下孵育2小時(shí)。 通過(guò)FlexStation（分子設(shè)備）添加ATP（50 µL /孔）以達(dá)到最終指示的濃度。

 

 

圖6.CHO-K細(xì)胞中內(nèi)源性P2Y受體對(duì)ATP的反應(yīng)。 將CHO-K細(xì)胞以每100 µL 40,000個(gè)細(xì)胞的孔接種在黑色96孔板中過(guò)夜。 將含有1 mM丙磺舒的HHBS中的100 µl 4 µM Cal 590 AM或Cal 630 AM加到孔中，并將細(xì)胞在37°C下孵育2小時(shí)。 將染料上樣介質(zhì)替換為100 µl HHBS和1 mM丙磺舒，然后在添加50 µl 300 µM ATP之前和之后使用TRITC通道用熒光顯微鏡（Olympus IX71）成像。

Cal-520、Cal-590、Cal-630相關(guān)產(chǎn)品：

貨號(hào)	產(chǎn)品名稱	規(guī)格
20605	CAL-520 生物素偶聯(lián)物	5x50ug
20606	CAL-520 生物胞素偶聯(lián)物	5x50ug
20609	CAL-520 NHS酯	100ug
20610	CAL-520 馬來(lái)酰亞胺	100ug
21130	CAL-520 AM *細(xì)胞滲透性*	10x50ug
21131	CAL-520 AM *細(xì)胞滲透性*	1mg
21135	CAL-520 鈉鹽	10x50ug
21136	CAL-520 鈉鹽	1mg
21140	CAL-520 鉀鹽	10x50ug
21141	CAL-520 鉀鹽	1mg
21142	Cal-520FF AM *可滲透細(xì)胞*	1mg
21143	Cal-520FF AM *可滲透細(xì)胞*	10x50ug
21144	Cal-520FF 鉀鹽	10x50ug
20600	CAL-520 葡聚糖偶聯(lián)物*分子量 3000 *	1mg
20601	CAL-520 葡聚糖偶聯(lián)物*分子量10000 *	5mg
20508	Cal-590™-葡聚糖偶聯(lián)物*分子量3,000 *	1mg
20509	Cal-590™-葡聚糖偶聯(lián)物*分子量10,000 *	1mg
20510	Cal-590 AM *可滲透細(xì)胞*	5x50ug
20511	Cal-590 AM *可滲透細(xì)胞*	10x50ug
20512	Cal-590 AM *可滲透細(xì)胞*	1mg
20530	Cal-630 AM *可滲透細(xì)胞*	5x50ug
20515	Cal-590 鈉鹽	5x50ug
20518	Cal-590 鉀鹽	5x50ug
20531	Cal-630 AM *可滲透細(xì)胞*	10x50ug
20532	Cal-630 AM *可滲透細(xì)胞*	1mg
20535	Cal-630 鈉鹽	5x50ug
20538	Cal-630 鉀鹽	5x50ug
20545	Cal-630 葡聚糖偶聯(lián)物*分子量3,000 *	1mg
20546	Cal-630 右旋糖酐偶聯(lián)物* MW 10,000 *	1mg
20588	Cal Red R525 / 650鉀鹽	5x50ug
20590	Cal Red R525 / 650 AM	1mg
20591	Cal Red R525 / 650 AM	10x50ug

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Calbryte 520、Calbryte 590、Calbryte 630

Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630為檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員提供了最強(qiáng)大的均相熒光分析工具。與現(xiàn)有的鈣指示劑（例如Fluo-3 AM，F(xiàn)luo-4 AM和Rhod-2 AM）相比，這些對(duì)鈣敏感的染料明顯更亮，并提供更高的信噪比，并大大改善了細(xì)胞內(nèi)保留和負(fù)載效率。一旦進(jìn)入細(xì)胞，Cal520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM的親脂性阻斷性AM基團(tuán)就會(huì)被細(xì)胞內(nèi)酯酶裂解，產(chǎn)生帶負(fù)電荷的熒光Calbryte 染料，并留在細(xì)胞內(nèi)。與鈣結(jié)合后，它們的熒光大大增強(qiáng)。當(dāng)細(xì)胞受到激動(dòng)劑刺激時(shí)，該受體發(fā)出信號(hào)通知細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放，從而明顯增加Calbryte 520，Calbryte 590或Calbryte 630的熒光。高靈敏度和大于100倍的熒光增強(qiáng)特性使Calbryte 520 AM， Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM是測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鈣的最強(qiáng)指示劑。

表3. Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630試劑的光譜和Ca²⁺結(jié)合特性。

Ca2+ 熒光探針	激發(fā)（Ex）	發(fā)射（Em）	Kd (µM)
Calbryte 520	492 nm	514 nm	1.2
Calbryte 590	580 nm	592 nm	1.4
Calbryte 630	608 nm	624 nm	1.2

 

 

圖7. CHO-K1細(xì)胞中內(nèi)源性P2Y受體對(duì)ATP的反應(yīng)。 將CHO-K1細(xì)胞以每100 µL 40,000個(gè)細(xì)胞的孔接種在黑色96孔板中過(guò)夜。 將含有丙磺舒的HHBS中的100 µL Fluo-4 AM或Calbryte 520 AM加入孔中，并將細(xì)胞在37°C下孵育45分鐘。 將染料加載介質(zhì)替換為200 µL HHBS，添加50 µL 50 µM ATP，并使用FITC通道在熒光顯微鏡（Keyence）上成像。

圖8.Calbryte 520或Fluo-4 AM測(cè)量的CHO-M1細(xì)胞中外源M1受體的卡巴膽堿刺激的鈣反應(yīng)。 將CHO-M1細(xì)胞以每100 µL每孔40,000個(gè)細(xì)胞的孔接種在黑色96孔板上。 將100 µL不含丙磺舒的Fluo-4 AM或Calbryte 520 AM加入細(xì)胞中，并將細(xì)胞在37℃下孵育45分鐘。 FlexStation 3（分子設(shè)備）添加了卡巴膽堿（50 µL /孔）以達(dá)到最終指示的濃度。

圖9. CHO-K細(xì)胞中內(nèi)源性P2Y受體對(duì)ATP的反應(yīng)。 將CHO-K細(xì)胞以每100 µL 40,000個(gè)細(xì)胞的孔接種在黑色96孔板上。 將含有2 mM丙磺舒的HHBS中的100 µL Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM加入孔中，并將細(xì)胞在37°C下孵育1小時(shí)。 將染料加載介質(zhì)替換為200 µL HHBS，用50 µL 50 µM ATP處理，并使用TRITC通道（Calbryte 590）和Texas Red Channel（Calbryte 630）用熒光顯微鏡（Keyence）成像。

 

Calbryte 520、Calbryte 590、Calbryte 630相關(guān)產(chǎn)品：

貨號(hào)	產(chǎn)品名稱	規(guī)格
20650	Calbryte 520 AM	2x50ug
20651	Calbryte 520 AM	10x50ug
20653	Calbryte 520 AM	1mg
20656	Calbryte 520，鉀鹽	2x50ug
20658	Calbryte 520，鉀鹽	10x50ug
20700	Calbryte 590 AM	2x50ug
20701	Calbryte 590 AM	10x50ug
20702	Calbryte 590 AM	1mg
20706	Calbryte 590，鉀鹽	5x50ug
20720	Calbryte 630 AM	2x50ug
20721	Calbryte 630 AM	10x50ug
20722	Calbryte 630 AM	1mg
20727	Calbryte 630，鉀鹽	5x50ug
36317	Screen Quest Calbryte 520 免丙磺舒和免洗鈣檢測(cè)試劑盒	1Plates
36318	Screen Quest Calbryte 520 免丙磺舒和免洗鈣檢測(cè)試劑盒	10Plates
36319	Screen Quest Calbryte 520 免丙磺舒和免洗鈣檢測(cè)試劑盒	100Plates
36200	Screen Quest Calbryte 590 免丙磺舒和免洗鈣檢測(cè)試劑盒	1Plates
36201	Screen Quest Calbryte 590 免丙磺舒和免洗鈣檢測(cè)試劑盒	10Plates
36202	Screen Quest Calbryte 590 免丙磺舒和免洗鈣檢測(cè)試劑盒	100Plates
20050	細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè) Pluronic F-127	10g
20052	細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè) Pluronic F-127 20% DMSO溶液	10ml
20053	細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè) Pluronic F-127 10%水溶液	10ml
20060	丙磺舒 細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)	10x72mg
20061	丙磺舒 ReadiUse 鈉鹽 水溶性	10x77mg
20062	丙磺舒 ReadiUse 25 mM穩(wěn)定的水溶液	10x10ml
36312	Cell Meter 鈣檢測(cè)免洗和免丙磺舒檢測(cè)試劑盒*適用于酶標(biāo)儀*	100Tests

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AAT 鈣離子產(chǎn)品分類

單波長(zhǎng)探針與比率探針

綠色熒光探針	紅色熒光探針	深紅色熒光探針	比率熒光探針（確定絕對(duì)和相對(duì)Ca2+濃度）	鈣離子免洗產(chǎn)品
Fluo-3 Fluo-4 Fluo-8 Cal-520 Calbryte 520	Rhod-2 Rhod-4 Cal-590 Calbryte 590	Cal-630 Calbryte 630	Fura-2 Fura-8 Fura-10 (NEW) Indo-1 Cal Red R525/650	Fluo-4（免洗）: 36325 Fluo-8（免洗）: 36315 Calbryte 520（免洗、免丙磺舒）：36318 Fura-2（免洗）：36320 Rhod-4（免洗）: 36334 Calbryte 590（免洗、免丙磺舒）: 36201

單波長(zhǎng)與比率法的優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比

單波長(zhǎng)	比率
1.在靜息鈣水平下背景熒光最小 2.良好的信噪比 3.大大提高了細(xì)胞內(nèi)保留 4.覆蓋光譜：紫外線（UV），紫色和可見(jiàn)光激發(fā) 5.不同的親和力（低、中、高）提供的敏感度滿足于各種應(yīng)用	1.準(zhǔn)確測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鈣濃度 2.將染料負(fù)載不均勻、染料泄漏、光漂白和細(xì)胞厚度變化（常見(jiàn)于混合群體）的影響降至最低 3.提供更可靠和可重復(fù)的結(jié)果 4.指示劑擁有雙激發(fā)/發(fā)射光線

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