通過(guò)ALPHA surefire ultra技術(shù)進(jìn)行定量的細(xì)胞水平磷酸化檢測(cè)
瀏覽次數(shù):2104 發(fā)布日期:2020-4-28
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小膠質(zhì)細(xì)胞是髓系細(xì)胞,在介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 中的炎性反應(yīng)方面起重要作用。在其他任務(wù)中,小膠質(zhì)細(xì)胞負(fù)責(zé)識(shí)別和消除外來(lái)入侵者,并修復(fù)由損傷引起的局部 CNS 組織損害。小膠質(zhì)細(xì)胞受體-接頭蛋白復(fù)合體 [稱(chēng)為骨髓細(xì)胞 2 表達(dá)的觸發(fā)受體 (TREM2) 和 12 kDa DNAX 激活蛋白 (DAP12)] 的功能經(jīng)證實(shí)在 AD 和帕金森病等多種神經(jīng)退行性疾病中非常重要。TREM2 和 DAP12 之間的相互作用很可能介導(dǎo)與吞噬和碎片清除、促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生和釋放的調(diào)節(jié),以及促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖和存活的轉(zhuǎn)錄變化有關(guān)的多種神經(jīng)炎性反應(yīng)。因此,TREM2/DAP12 功能變化直接影響小膠質(zhì)細(xì)胞激活的時(shí)間和程度,從而影響神經(jīng)元功能和存活。
TREM2 是一種跨膜糖蛋白,由胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)部分,其中胞質(zhì)部分與 DAP12 結(jié)合,起到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。TREM2 有來(lái)自病原體的外源配體,還有暫時(shí)尚未明確的內(nèi)源配體。胞外配體結(jié)合會(huì)激活 TREM2,這反過(guò)來(lái)會(huì)激活 DAP12,從而導(dǎo)致胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)。具體而言,DAP12 包含一個(gè)基于免疫受體酪氨酸的激活基序 (ITAM),其中酪氨酸殘基在 TREM2 結(jié)合配體時(shí)會(huì)被磷酸化。然后這會(huì)募集 Syk 激酶來(lái)激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。
本文采用了 TREM2-/- 的小鼠對(duì) TREM2 在脂質(zhì)代謝以及 TREM2 缺失引起的小膠質(zhì)細(xì)胞的膽固醇堆積的來(lái)源進(jìn)行了探討。發(fā)現(xiàn)TREM2在小膠質(zhì)細(xì)胞脂質(zhì)代謝過(guò)程中的重要作用以及myelin是膽固醇堆積的重要來(lái)源。TREM2 正常表達(dá)的動(dòng)物和細(xì)胞在 TREM2 收到激活后,可以引起 DAP12 的自磷酸化,進(jìn)一步招募 SYK 蛋白并將其磷酸化,激活 SYK 信號(hào)通路,激活下游的 DAM 和脂類(lèi)代謝的基因,從而將小膠紙細(xì)胞吞噬的 myelin 膽固醇正常代謝為自由化的膽固醇。本文前期的大量的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都驗(yàn)證了 TREM2 的功能,同時(shí)也構(gòu)建了SYK的磷酸化檢測(cè)平臺(tái),通過(guò) ALPHA surefire ultra 的技術(shù)對(duì) SYK 的磷酸化水平進(jìn)行定量分析。
ALPHA surefire ultra技術(shù)是珀金埃爾默公司基于ALPHA平臺(tái)開(kāi)發(fā)出的細(xì)胞磷酸化檢測(cè)工具。新的 AlphaLISA Surefire Ultra 采用成熟的 CaptSureTM 技術(shù)代替 Protein A,不僅實(shí)現(xiàn)了試劑盒抗體捕獲的特異性,而且具有更低的檢測(cè)背景。新的試劑盒利用 AlphaLISA 受體微珠代替 AlphaScreen 受體微珠,對(duì)血紅蛋白淬滅干擾具有更加出色的光譜特性。ALPHA 檢測(cè)本身非常簡(jiǎn)單。
ALPHA surefire Ultra 平臺(tái)的特點(diǎn):
- 步驟簡(jiǎn)單,減少時(shí)間和人工
- 細(xì)胞樣本經(jīng)過(guò)刺激、裂解后,只需要將試劑組分加入裂解液,無(wú)需任何多余的洗滌步驟。
- 高靈敏度及定量化檢測(cè)
- 檢測(cè)靈敏度大于等于 Western Blot 方法;可以檢測(cè)過(guò)表達(dá)蛋白靶點(diǎn)及內(nèi)源水平表達(dá)的蛋白;可以使用穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系或原代細(xì)胞及干細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。
- 高Z'值和信號(hào)窗口
- 可以獲得更高的信噪比、更低的cv以及更穩(wěn)定的assay。
- 通量高的同時(shí)上樣量少
- 可以兼容 96、384 或 1536 孔板的不同檢測(cè)模式,適合于微孔板樣品,樣品只需 5uL 或以下的體積。
本文中將 TREM2 和 DAP12 共同表達(dá)在 293T 細(xì)胞中共同表達(dá),以此為平臺(tái)使用不同的脂類(lèi)和蛋白類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行刺激,然后檢測(cè)其 Syk 的磷酸化水平的變化。
珀金埃爾默同時(shí)提供Phospho-Syk (Tyr352)和total Syk檢測(cè)試劑盒。