對(duì)于新型冠狀病毒的相關(guān)信息，我們一直在進(jìn)行深入調(diào)研，希望能為科研助一臂之力。前面的推文中我們已經(jīng)提到了細(xì)胞因子風(fēng)暴、跨膜蛋白酶等在新型冠狀病毒入侵宿主時(shí)所發(fā)揮的作用，那么除了這些，還會(huì)有別的因子起作用嗎？它們又扮演著怎樣的角色呢？根據(jù)調(diào)研，我們發(fā)現(xiàn)LY6E和CD209L兩類免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白在病毒與宿主受體作用時(shí)發(fā)揮了作用，下面進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

 

LY6E

 

LY6E與病毒相關(guān)的研究從2000年才開(kāi)始逐漸發(fā)展起來(lái)，2001年報(bào)道了LY6E在一種致癌性禽皰疹病毒引起的馬立克氏病中的差異表達(dá)。之后研究發(fā)現(xiàn)LY6E蛋白可以增加宿主對(duì)于I型小鼠腺病毒（MAV-1）以及HIV-1的易感性，除了這些，LY6E還與許多RNA病毒的感染增強(qiáng)有關(guān)，比如黃熱病病毒（YFV）、登革熱病毒（DENV）、寨卡病毒（ZIKV）、甲型流感病毒（IAV）等。在機(jī)理研究方面，已有研究證明GPI錨定的蛋白與細(xì)胞骨架重排相關(guān)，如果LY6E參與了骨架重排，那么這對(duì)病毒進(jìn)入細(xì)胞來(lái)說(shuō)也是非常關(guān)鍵的，也就是說(shuō)，LY6E分子有可能參與了病毒顆粒被宿主細(xì)胞內(nèi)化的過(guò)程。

 

LY6E對(duì)病毒感染的作用機(jī)制是怎樣的呢？有直接作用和間接作用，這取決于LY6E如何調(diào)節(jié)病毒感染，以哪種類型的細(xì)胞感染以及病毒本身的特異性：

 

● 首先，LY6E是GPI錨定的蛋白質(zhì)，富含脂筏微結(jié)構(gòu)域，調(diào)節(jié)內(nèi)吞運(yùn)輸和信號(hào)傳導(dǎo)等膜依賴性過(guò)程，可以影響病毒糖蛋白或受體蛋白的表達(dá)及生物學(xué)特性，從而影響病毒與受體的結(jié)合、運(yùn)輸以及膜融合。在HIV-1的研究中，已經(jīng)表明LY6E是通過(guò)調(diào)節(jié)病毒半融合狀態(tài)來(lái)促進(jìn)病毒融合并增強(qiáng)其進(jìn)入細(xì)胞的能力。

 

● 其次，GPI錨定的LY6蛋白可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排，從理論上講，GPI錨定的蛋白質(zhì)可能不會(huì)與細(xì)胞骨架分子直接發(fā)生相互作用，因?yàn)樗鼈儫o(wú)法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，而正因?yàn)檫@樣，這些蛋白質(zhì)可以與多種跨膜分子關(guān)聯(lián)，例如Src家族激酶和整合蛋白，這種間接的相互作用可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)，也就是說(shuō)，LY6E對(duì)不同病毒的感染力增強(qiáng)或者減弱，很大程度是由LY6E對(duì)細(xì)胞骨架重排上的影響造成的，具體是增強(qiáng)還是減弱，可能還跟細(xì)胞類型和病毒本身的特異性相關(guān)。

 

● 第三方面，LY6E可以調(diào)節(jié)包括宿主免疫應(yīng)答在內(nèi)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這對(duì)病毒感染的預(yù)防非常重要。我們都知道，細(xì)胞因子、趨化因子等參與了IFN-I信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過(guò)一系列的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)促使機(jī)體對(duì)病原體的清除。研究表明，細(xì)胞表面的LY6E的抗體交聯(lián)激活了T細(xì)胞，而T細(xì)胞的生理活性會(huì)影響到病毒的感染和存活。Yeom等人的研究表明LY6E可以通過(guò)PTEN/PI3K/Akt/HIF-1軸來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤的生長(zhǎng)，特別是在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)PTEN而上調(diào)HIF-1α基因。LY6E和LY6K還可以通過(guò)改變TGFβ依賴性的乳腺癌細(xì)胞的生理機(jī)制而參與乳腺癌的增殖，而TGFβ廣泛參與病毒感染和發(fā)病機(jī)制，研究證實(shí)，LY6E與先天性免疫信號(hào)之間可直接相互作用，LY6E下調(diào)CD14，而CD14是TLR4/CD14/NF-κB通路的關(guān)鍵分子，這會(huì)導(dǎo)致先天性免疫激活產(chǎn)生負(fù)反饋回路，為病毒的感染提供了新的路徑。需要指出的是，LY6E是質(zhì)膜靶向蛋白，但也可以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

 

有趣的是，Katrina B. Mar等人通過(guò)抗病毒ISG篩選，發(fā)現(xiàn)LY6E增強(qiáng)了病毒感染，研究結(jié)果顯示，在不同細(xì)胞中易位表達(dá)LY6E增強(qiáng)了多種RNA病毒的感染性，LY6E不會(huì)損害IFN的抗病毒活性或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，但是會(huì)促進(jìn)病毒進(jìn)入細(xì)胞。

 

2020年3月5日瑞士伯爾尼大學(xué)病毒學(xué)與免疫學(xué)研究所Stephanie Pfaender等發(fā)現(xiàn)LY6E可以破壞冠狀病毒與宿主細(xì)胞融合，并調(diào)控免疫進(jìn)程。這篇文章發(fā)表在bioRxiv上。冠狀病毒具有廣泛的宿主嗜性，有越過(guò)物種壁壘感染人類的能力，哺乳動(dòng)物的先天免疫應(yīng)答有部分是通過(guò)干擾素來(lái)控制的，干擾素誘導(dǎo)多個(gè)基因來(lái)抑制病毒感染，其中就包括LY6E。而在人類、恒河猴、小鼠、蝙蝠和駱駝來(lái)源的LY6E直向同源物的比對(duì)解釋了物種間的強(qiáng)保守性。這篇研究展示了LY6E有效地限制了由多個(gè)冠狀病毒引起的細(xì)胞感染，包括SARS-CoV，SARS-CoV-2和MERS-CoV，研究表明，LY6E通過(guò)干擾spike蛋白介導(dǎo)的膜融合來(lái)抑制冠狀病毒進(jìn)入細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)中，研究者用到了造血干細(xì)胞中缺乏Ly6e的小鼠和Ly6e基因敲除小鼠，二者都極易受到冠狀病毒的感染，且發(fā)病程度加劇，伴隨著肝、脾臟免疫細(xì)胞的丟失和整體抗病毒感染途徑的減少等現(xiàn)象的出現(xiàn)。

 

對(duì)于LY6E在冠狀病毒中的研究我們還需要進(jìn)一步去證實(shí)，鑒于該基因目前的功能，我們對(duì)SARS-CoV-2又有了新的了解，對(duì)抗病毒藥物的研發(fā)無(wú)疑又是一個(gè)新的啟發(fā)。

 

L-SIGN（CD209L）

 

C型凝集素是在抗原呈遞細(xì)胞上的跨膜蛋白，能夠以鈣依賴性的方式對(duì)糖類復(fù)合物中的碳水化合物進(jìn)行特異性識(shí)別。在免疫反應(yīng)過(guò)程中C型凝集素介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用，識(shí)別內(nèi)源性受體，并且維持內(nèi)源性糖蛋白的穩(wěn)態(tài)。DC-SIGN是一種在樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）表面表達(dá)的C型凝集素，可與HIV和猿猴免疫缺陷病毒有效結(jié)合并傳播給易感細(xì)胞。C型凝集素還有一種是DC-SIGNR，也稱為L(zhǎng)-SIGN和CD209L。在某些情況下，C型凝集素是病原體（包括病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)和真菌）侵襲細(xì)胞的受體，最典型的是DC-SIGN，在未成熟的DC和巨噬細(xì)胞亞群中均有表達(dá)，而L-SIGN與DC-SIGN具有77%的氨基酸序列同源性，可感染淋巴結(jié)和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，與絲狀病毒、冠狀病毒、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)膜腦炎病毒等的感染相關(guān)。

 

Stefan Pohlmann等人在2001年時(shí)就發(fā)現(xiàn)了L-SIGN與DC-SIGN相似，可以與HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒等毒株結(jié)合，引起T細(xì)胞系和人外周血單核細(xì)胞的感染。Bashirova AA等在“樹(shù)突狀細(xì)胞特異性胞間黏附分子3（ICAM-3）與DC-SIGN相關(guān)蛋白在人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞上高表達(dá)并促進(jìn)HIV-1感染”的研究中表明，L-SIGN與DC-SIGN相比，對(duì)ICAM-3具有更高的親和力，通過(guò)與ICAM-3的結(jié)合，增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)HIV-1的敏感性。

 

病毒與L-SIGN的結(jié)合取決于碳水化合物的識(shí)別，而與病毒結(jié)合的黏附因子在多種內(nèi)皮細(xì)胞中的存在表明L-SIGN可以通過(guò)與不同器官內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子結(jié)合而實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞間的活動(dòng)，使HIV-1能夠穿越某些器官的毛細(xì)血管內(nèi)皮以及在病毒呈遞中發(fā)揮作用，HIV包膜（Env）蛋白與細(xì)胞表面分子之間的相互作用決定了哪些細(xì)胞易受到病毒侵襲以及侵襲的效率。樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）能夠幫助結(jié)合的病毒有效地傳到外周單核細(xì)胞，即使DC本身未受到感染或感染效率低下，也能導(dǎo)致單核細(xì)胞強(qiáng)烈的感染。Leah GiLlespie的研究發(fā)現(xiàn)，DC-SIGN和L-SIGN是促進(jìn)人偏肺病毒（human metapneumovirus，HMPV）感染靶細(xì)胞的附著因子。Marzi等人的研究證明，SARS-CoV Spike糖蛋白的逆轉(zhuǎn)錄假病毒可以與DC-SIGN和CD209L結(jié)合，但不依賴于這些凝集素進(jìn)入細(xì)胞，同時(shí)他們還證明了CD209L在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、Peyer‘s淋巴細(xì)胞、回腸末端絨毛固有層的毛細(xì)血管以及II型肺泡細(xì)胞和肺內(nèi)皮細(xì)胞中對(duì)SARS-CoV具有受體活性。

 

Jeffers SA等用編碼CD209L的cDNA轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO），發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞對(duì)SARS-CoV變得敏感，進(jìn)一步的研究表明CD209L可能是SARS-CoV的一種弱受體，同時(shí)，研究還證明了CD209L對(duì)于hCoV229E來(lái)說(shuō)，是一種比hAPN活性更弱的受體。而SARS-CoV可能通過(guò)S蛋白上的高甘露聚糖與質(zhì)膜上的CD209L結(jié)合，然后介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。顯然，CD209L蛋白在病毒和宿主細(xì)胞表面起到了橋梁的作用。已經(jīng)有報(bào)告證明，樹(shù)突狀細(xì)胞上的DC-SIGN是埃博拉病毒、HIV-1和其他包膜病毒的附著因子，樹(shù)突狀細(xì)胞是專業(yè)的抗原呈遞細(xì)胞，可將病毒呈遞給巨噬細(xì)胞或者CD4+T細(xì)胞。

 

Dong P. Han等在對(duì)SARS進(jìn)行研究的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，DC-SIGN和L-SIGN介導(dǎo)的SARS病毒感染的關(guān)鍵位點(diǎn)是特定的天冬酰胺連接的糖基化位點(diǎn)，他們提到，S糖蛋白上的高甘露聚糖對(duì)DN/L-SIGN介導(dǎo)的病毒感染很重要，定點(diǎn)誘變分析已經(jīng)鑒定出S蛋白上7個(gè)關(guān)鍵的糖基化位點(diǎn)，分別是109，118，119，158，227，589和699位的天冬酰胺殘基，而我們知道，病毒S蛋白R(shí)BD結(jié)構(gòu)域與ACE2結(jié)合的氨基酸殘基位于318-510區(qū)域。從動(dòng)物到人類分離的SARS-CoV編碼S蛋白氨基酸序列分析表明，糖基化位點(diǎn)N227和N699促進(jìn)了人畜共患病的傳播。Zhi-Yong Yang等人的研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV的S糖蛋白可以通過(guò)pH依賴的方式介導(dǎo)細(xì)胞的內(nèi)吞作用使病毒進(jìn)入。2008年香港學(xué)者US Khoo等表明L-SIGN的多肽區(qū)域變體的雜合表達(dá)可能會(huì)改變病毒與配體的結(jié)合能力，而炎性因子在SARS感染中同樣起作用，這些都有助于增加SARS的易感性。Vera S F Chan等發(fā)現(xiàn)，與L-SIGN雜合的細(xì)胞相比，L-SIGN純和的細(xì)胞顯示出更高的與SARS-CoV結(jié)合的能力，更高的蛋白酶體依賴性病毒降解能力和更低的反式感染能力，因此，他們認(rèn)為，L-SIGN的純和性在SARS感染期間對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用。

 

另外，也有研究表明，肺表面活性蛋白D（SP-D），該C型凝集素超家族成員包含與CD209L類似的碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域，是一種重要的宿主先天防御分子，可與細(xì)菌和病毒表面的高甘露聚糖結(jié)合，被SP-D包被的細(xì)菌和病毒形成聚集體，被巨噬細(xì)胞吞噬，由于可溶性CD209L可以與hCoV-229E病毒體結(jié)合并增強(qiáng)病毒與受體細(xì)胞的結(jié)合，因此SP-D也可能與hCoV-229E結(jié)合并介導(dǎo)病毒的黏附、侵入以及最終進(jìn)入巨噬細(xì)胞和II型肺泡細(xì)胞。此外，肺泡表面活性劑在保護(hù)肺方面的作用不容小覷，它可以通過(guò)中和過(guò)度炎癥反應(yīng)過(guò)程中所產(chǎn)生的氧化自由基，來(lái)達(dá)到保護(hù)目的。因此，SP-D為藥物研發(fā)方面也提供了一種非常有用的途徑。

 

綜上所述，我們對(duì)SARS-CoV-2的研究，需要從更廣泛的角度去理解病毒與受體之間的結(jié)合方式，才能在更深入的了解病毒的特征基礎(chǔ)上做出針對(duì)性的抗病毒制劑。共同攻堅(jiān)，我們一起努力。

 

 

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