冠狀病毒防御戰(zhàn)之巨噬細(xì)胞
 您了解冠狀病毒嗎？ 冠狀病毒(CoV)是自然界廣泛存在的一類(lèi)病毒，因該病毒的形態(tài)在電鏡下觀察類(lèi)似王冠而得名。其基因總長(zhǎng)約28~32 kb，基因組大致可分成6到7個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域均包含至少1條開(kāi)放閱讀框(opten-reading frame，ORF)。CoV顆粒的直徑約60～200 nm，平均直徑為100 nm，呈球形或橢圓形，是目前發(fā)現(xiàn)最大的RNA類(lèi)病毒。 ┇ CoV主要有4種結(jié)構(gòu)蛋白~ ┇  少數(shù)冠狀病毒還具有血凝素酯酶(Hemagglutinin esterase, HE)糖蛋白。  圖1：冠狀病毒結(jié)構(gòu)模式圖 ▲▼ 新冠病毒的特性 ▼▲ 目前為止發(fā)現(xiàn)冠狀病毒僅感染脊椎動(dòng)物，可引起人和動(dòng)物呼吸道、消化道、泌尿生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。2019新型冠狀病毒(COVID-19)是新發(fā)現(xiàn)的可以感染人和動(dòng)物的冠狀病毒，是目前已知的第7種可以感染人的冠狀病毒，其余6種分別是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV(引發(fā)重癥急性呼吸綜合征)和MERS-CoV(引發(fā)中東呼吸綜合征)。
COVID-19傳播途徑主要是呼吸道飛沫傳播、接觸傳播和糞-口傳播，氣溶膠等其它傳播途徑尚待進(jìn)一步明確。感染了COVID-19后患者常伴有呼吸道癥狀、發(fā)熱、咳嗽、氣促和呼吸困難等，在較嚴(yán)重病例中，感染可導(dǎo)致肺炎、嚴(yán)重急性呼吸綜合征、腎衰竭，甚至死亡。目前對(duì)于COVID-19所致疾病沒(méi)有特效治療方法，一般根據(jù)患者臨床癥狀進(jìn)行對(duì)癥治療。此外，患者免疫功能的狀態(tài)直接影響疾病的預(yù)后與轉(zhuǎn)歸。 通過(guò)對(duì)臨床病例的分析，發(fā)現(xiàn)女性在COVID-19感染后不僅癥狀相對(duì)較輕，而且比男性有更長(zhǎng)的潛伏期，男性感染后的病死率高于女性，在確診的2019-nCoV重癥感染者里面，大量的患者出現(xiàn)了“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，在患者體液中可以檢測(cè)到多種細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MCP-1和IL-8等大量產(chǎn)生的現(xiàn)象，是引起急性呼吸窘迫綜合癥和多器官衰竭的重要原因[2, 3]。在此前非典，中東呼吸綜合征和埃博拉病毒等感染疾病案例證明，細(xì)胞因子風(fēng)暴才是真正的奪命殺手，可以觸發(fā)免疫系統(tǒng)對(duì)身體的猛烈攻擊。這也是為什么針對(duì)COVID-19患者需要輔以激素治療，調(diào)控我們的免疫系統(tǒng)，避免自身細(xì)胞被免疫系統(tǒng)過(guò)度攻擊。 少數(shù)冠狀病毒還具有血凝素酯酶(Hemagglutinin esterase, HE)糖蛋白。 ▲▼ 巨噬細(xì)胞在病毒感染后的作用 ▼▲
巨噬細(xì)胞是機(jī)體最重要的免疫細(xì)胞之一，在流感病毒感染后，巨噬細(xì)胞可迅速到達(dá)肺部感染處，對(duì)局部微環(huán)境反應(yīng)的不同，巨噬細(xì)胞會(huì)發(fā)生不同類(lèi)型的極化。根據(jù)極化后巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志物及其功能，可將極化后的巨噬細(xì)胞類(lèi)型分為經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(Classically activated macrophage, M1)和替代性活化的巨噬細(xì)胞(Alternatively activated macrophage, M2)兩大類(lèi)。
M1型巨噬細(xì)胞能吞噬并清除外來(lái)病原體，激活Ｔ細(xì)胞的免疫反應(yīng)，分泌促炎因子，參與細(xì)胞因子風(fēng)暴的形成，加速細(xì)胞外基質(zhì)降解和細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)并促進(jìn)Th1型免疫應(yīng)答。 M2型巨噬細(xì)胞能促進(jìn)組織修復(fù)和傷口愈合，調(diào)節(jié)Th2 型免疫應(yīng)答，有助于組織重塑。而性激素可以調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化，已有文獻(xiàn)報(bào)道雌激素在病毒感染性疾病中具有保護(hù)作用，究其原因是雌激素可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞方向分化，減輕機(jī)體的炎癥反應(yīng)，有利于疾病的轉(zhuǎn)歸[4, 5]。結(jié)合COVID-19感染后女性發(fā)病程度較輕，并且死亡率較男性低的特點(diǎn)，可以推測(cè)在雌激素的影響下，M1/M2 的不平衡極化在COVID-19感染中起著重要作用，調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的方向有望能改善疾病的發(fā)生發(fā)展，因此深入了解巨噬細(xì)胞的生物學(xué)功能及極化機(jī)制對(duì)病毒感染相關(guān)疾病的預(yù)防和治療具有一定的指導(dǎo)意義。 接下來(lái)將就巨噬細(xì)胞起源、極化以及鑒定做進(jìn)一步總結(jié)，希望能有助于大家研究巨噬細(xì)胞。 巨噬細(xì)胞
▲▼ 巨噬細(xì)胞的起源 ▼▲ 巨噬細(xì)胞(Macrophage)是單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)晚期分化細(xì)胞，是機(jī)體的主要免疫細(xì)胞，在先天性免疫和獲得性免疫反應(yīng)中都起著重要的作用，它由骨髓造血祖細(xì)胞發(fā)育分化釋放進(jìn)入外周血，隨后進(jìn)一步分化為組織定居的巨噬細(xì)胞，如肺臟中的塵細(xì)胞、肝臟中的庫(kù)普弗細(xì)胞(Kupffer cell)、皮膚中的朗格漢斯細(xì)胞(langerhans cell)、腦組織中的小膠質(zhì)細(xì)胞和骨組織中的破骨細(xì)胞等[6]。單核細(xì)胞在分化為巨噬細(xì)胞的過(guò)程中，形態(tài)和功能發(fā)生較大改變，主要表現(xiàn)為體積增大、細(xì)胞器數(shù)量增加、吞噬功能增強(qiáng)并能分泌大量可溶性細(xì)胞因子等。機(jī)體所受到的免疫刺激、分泌的促炎因子以及代謝因素均能夠促進(jìn)單核細(xì)胞向外周組織中遷移并分化為巨噬細(xì)胞，以增強(qiáng)機(jī)體防御，組織重塑和修復(fù)[7]。
巨噬細(xì)胞具有異質(zhì)性和多樣性，在體液免疫和細(xì)胞免疫中均發(fā)揮著不可替代的作用，受不同因素刺激時(shí)巨噬細(xì)胞會(huì)發(fā)生不同類(lèi)型的極化，根據(jù)極化后巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志物及其功能，可將極化后的巨噬細(xì)胞類(lèi)型分為經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(Classically activated macrophage, M1)和替代性活化的巨噬細(xì)胞(Alternatively activated macrophage, M2)兩大類(lèi)。M1型巨噬細(xì)胞能吞噬并清除外來(lái)病原體，分泌促炎因子，激活Ｔ細(xì)胞的免疫反應(yīng)，在炎癥初期發(fā)揮重要作用。M2型巨噬細(xì)胞能促進(jìn)組織修復(fù)和傷口愈合，在炎癥后期有利于疾病的恢復(fù)。Mantovani等提出進(jìn)一步對(duì)M2細(xì)胞進(jìn)行亞型分類(lèi)：由IL-4或IL-13誘導(dǎo)產(chǎn)生的M2a型巨噬細(xì)胞、由Toll樣受體(toll like receptors，TLRs)的配體誘導(dǎo)產(chǎn)生M2b型巨噬細(xì)胞和由IL-10和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)產(chǎn)生的M2c型巨噬細(xì)胞[8]。在炎癥反應(yīng)過(guò)程中巨噬細(xì)胞的極化能夠相互轉(zhuǎn)換，發(fā)揮不同功能，在炎癥早期M1型巨噬細(xì)胞通過(guò)釋放促炎細(xì)胞因子，招募和激活適應(yīng)性免疫細(xì)胞，從而誘導(dǎo)Th1 和Th17 反應(yīng)，在促進(jìn)炎癥反應(yīng)過(guò)程中可能會(huì)對(duì)機(jī)體正常組織造成損傷，而當(dāng)機(jī)體處于炎癥恢復(fù)階段時(shí)，這些細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為M2 型巨噬細(xì)胞，抑制炎癥反應(yīng)，從而誘導(dǎo)Th2 反應(yīng)，參與組織愈合和修復(fù)[9]。 ▲▼ 體外巨噬細(xì)胞極化方案 ▼▲
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| 圖2：人巨噬細(xì)胞極化步驟 |
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| 而體外小鼠的巨噬細(xì)胞的研究由骨髓細(xì)胞分化而來(lái)，骨髓細(xì)胞加入 20ng/ml M-CSF，隔天半量換液，誘導(dǎo)分化 6 天后即為 BMDM0，加 20ng/ml IFN-γ和LPS極化一天分化為BMDM1；加20ng/ml的IL-4/IL-10極化一天，即分化為 BMDM2(圖3)。 |
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| 圖3：小鼠巨噬細(xì)胞極化步驟 |
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| ▲▼ 巨噬細(xì)胞的鑒定 ▼▲ |
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| 對(duì)分化后的人單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞進(jìn)行表型鑒定發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細(xì)胞CD14 高表達(dá)，清道夫受體(Scavenger receptors, SR,CD163)低表達(dá)，甘露糖受體(Mannose receptors, MR, CD206)不表達(dá)；在 M2 細(xì)胞中，CD14 高表達(dá)，CD163 和 CD206均高表達(dá); 在 M0 細(xì)胞中，CD14 高表達(dá)，CD163 低表達(dá)，CD206 中表達(dá)。同時(shí)對(duì)三種巨噬細(xì)胞進(jìn)行分泌細(xì)胞因子的鑒定，M0、M1 細(xì)胞經(jīng)LPS活化后，以釋放大量促炎性細(xì)胞因子 TNF-α 為主，幾乎不釋放 IL-10；而M2 細(xì)胞經(jīng)LPS活化后，則以釋放大量抑炎性細(xì)胞因子 IL-10 為主，只釋放少量的 TNF-α[10]。 對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞來(lái)源的不同亞型巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子分析發(fā)現(xiàn)：M1型巨噬細(xì)胞IL-12 水平顯著上升, 其IL-10 的分泌略有增加，同時(shí)高表達(dá)iNOS；而M2型巨噬細(xì)胞其IL-10分泌水平明顯增加, 而IL-12 水平很低，Arginase-Ⅰ的表達(dá)和活性顯著增加。其表面標(biāo)志性分子表達(dá)分析：M2 與M1 型巨噬細(xì)胞相比，CD163、CD206 和Dectin-1 表達(dá)明顯上調(diào)[4]。 |
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| ▲▼ 巨噬細(xì)胞功能 ▼▲ |
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| M1型巨噬細(xì)胞由IFN-γ及LPS等極化產(chǎn)生，釋放TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23等促炎性細(xì)胞因子，抗原提呈能力和吞菌能力增強(qiáng)，作為抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells, APCs)，能夠促進(jìn)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的發(fā)生。M2型巨噬細(xì)胞由IL-4 或IL-13 誘導(dǎo)，CD206 和精氨酸酶表達(dá)增高，內(nèi)吞能力增強(qiáng)，分泌IL-10、TGF-β等抑炎性細(xì)胞因子、促進(jìn)Th2細(xì)胞分化，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及組織修復(fù)功能，其抗原提呈能力較弱，在寄生蟲(chóng)免疫反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)、傷口愈合和組織重構(gòu)中發(fā)揮重要作用[5, 11]。M2 型巨噬細(xì)胞的不同亞型分別發(fā)揮不同功能(圖4)。M2a 由IL-4 或IL-13誘導(dǎo)產(chǎn)生，高表達(dá)CD206，內(nèi)吞活性增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和組織修復(fù)，介導(dǎo) Th2 型免疫反應(yīng)。M2b 由免疫復(fù)合物和LPS /IL-1 刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生，可以同時(shí)產(chǎn)生抗炎和促炎細(xì)胞因子IL-10、IL-1β、IL-6，執(zhí)行免疫調(diào)節(jié)功能，并能促進(jìn)Th2活化并增強(qiáng)體液免疫。M2c 型巨噬細(xì)胞，又稱(chēng)失活型巨噬細(xì)胞，由糖皮質(zhì)激素、IL-10 或TGF-β 誘導(dǎo)產(chǎn)生，低表達(dá)MHCII 分子，在基質(zhì)沉淀和組織重塑中發(fā)揮作用，此外，M2c型巨噬細(xì)胞可通過(guò)釋放大量的IL-10和TGF-β抑制免疫反應(yīng)，對(duì)凋亡細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗炎作用[5, 12]。 |
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| 圖4：不同巨噬細(xì)胞亞型功能 |
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| ▲▼ 病毒感染調(diào)控巨噬細(xì)胞極化過(guò)程 ▼▲ |
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| 在病毒感染急性期，巨噬細(xì)胞向M1方向極化，M1型巨噬細(xì)胞可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，輔助機(jī)體清除病原體，但其過(guò)度活化可引起細(xì)胞因子風(fēng)暴，加重組織的免疫病理?yè)p傷，且M1 型巨噬細(xì)胞極化比例與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān); 隨著病毒感染相關(guān)疾病的進(jìn)展，巨噬細(xì)胞向M2方向極化，M2型巨噬細(xì)胞可通過(guò)分泌多種抑炎因子發(fā)揮免疫調(diào)控作用，參與組織修復(fù)[13, 14]。巨噬細(xì)胞極化不是M1 /M2 兩個(gè)極端，而是一個(gè)連續(xù)的巨噬細(xì)胞活化譜。Herbein等基于逆轉(zhuǎn)錄病毒感染提出了M1 /M2 重塑模型，即在感染早期M1型巨噬細(xì)胞極化占優(yōu)勢(shì)，M1型巨噬細(xì)胞是機(jī)體細(xì)胞因子風(fēng)暴和免疫病理?yè)p傷產(chǎn)生的重要因素。在感染慢性期M2型巨噬細(xì)胞極化占優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)組織修復(fù)并重建免疫穩(wěn)態(tài)抑制M1型巨噬細(xì)胞方向極化，有利于控制炎癥反應(yīng)，改善急性病毒感染患者的疾病預(yù)后[15]。 | |
| 巨噬細(xì)胞是一種異質(zhì)性與可塑性較強(qiáng)的細(xì)胞，在病毒感染誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的進(jìn)展和消退中巨噬細(xì)胞極化發(fā)揮重要的雙重調(diào)控作用，是極具潛力的治療急性病毒感染所致疾病的細(xì)胞。闡明巨噬細(xì)胞極化在病毒感染過(guò)程中的作用及相關(guān)調(diào)控機(jī)制，可為病毒感染性疾病的發(fā)病機(jī)制研究及治療策略提供新的思路。 |
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| 巨噬細(xì)胞研究用相關(guān)產(chǎn)品 |
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| ▲▼ 培養(yǎng)用細(xì)胞因子 ▼▲ |
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| ▲▼鑒定用流式抗體配色方案 ▼▲ |
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| ▲▼鑒定用流式抗體配色方案 ▼▲ |
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| ▲▼極化研究推薦小分子▼▲ |
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| 參考文獻(xiàn) | |
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1.McBride, R., M. van Zyl, and B.C. Fielding, The coronavirus nucleocapsid is a multifunctional protein. Viruses, 2014. 6(8): p. 2991-3018. |
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