Ames試驗（沙門氏菌回復突變試驗）方法及導則
鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗（Ames試驗，Salmonella Typhimurium / Reverse Mutation Assay）于 1975年建立并不斷發(fā)展完善，目前已被世界各國廣為采用，已經(jīng)成為毒理學實驗室必需開展的重要實驗項目。Ames實驗用于檢測待分析物質(zhì)的致突變作用，該驗靈敏、高效、檢測范圍廣。
Ames 試驗原理
Ames 試驗利用鼠傷寒沙門氏組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，該缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復突變的細菌生長；假如有致突變物存在，則營養(yǎng)缺陷型的細菌誘導回復突變成原養(yǎng)型，因而能生長形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物。某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復突變， 故需加入經(jīng)誘導劑誘導的大鼠肝制備的 S9混合液。北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司針對Ames試驗開發(fā)Ames試劑盒， 本試劑盒省去了培養(yǎng)基成分準備、誘導 S9 制備、菌株 鑒定、菌株培養(yǎng)等時間，可以直接使用，大大縮短了實驗周期；試劑盒各成分均經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，無雜菌污染，菌株特性與活菌數(shù)目以及誘導 S9 活性均符合 Ames 試驗要求，實驗結(jié)果準確、可靠、重現(xiàn)性高。Ames試劑盒應用廣泛，可進行食品與飲用水、化學品、洗滌劑、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝材料等多個方面的遺傳毒理學檢測。
Ames試驗導則
1 范圍
本規(guī)范確定了鼠傷寒沙門氏菌／回復突變試驗的基本原則、要求和方法。
本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品的基因突變檢測。
2 規(guī)范性引用文件
OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No.471,Adopted:21,July 1997)。
3 定義
3.1 回復突變（Reverse mutation）
細菌在化學致突變物作用下由營養(yǎng)缺陷型回變到原養(yǎng)型(prototroph)。
3.2 基因突變 （Gene mutation）
在化學致突變物作用下細胞DNA中堿基對的排列順序發(fā)生變化。
3.3 堿基置換突變 （Base substitution mutation）
引起DNA鏈上一個或幾個堿基對的置換。
堿基置換有轉(zhuǎn)換(transition)和顛換(transversion)兩種形式。
轉(zhuǎn)換是DNA鏈上的一個嘧啶被另一嘧啶所替代，或一個嘌呤被另一嘌呤所代替。
顛換是DNA鏈上的一個嘧啶被另一嘌呤所替代，或一個嘌呤被另一嘧啶所代替。
3.4 移碼突變（ Frameshift mutation）
引起DNA鏈上增加或缺失一個或多個堿基對。
3.5 鼠傷寒沙門氏菌/回復突變試驗（ Salmonella typhimurium/reverse mutation assay）
利用一組鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型試驗菌株測定引起沙門氏菌堿基置換或移碼突變的化學物質(zhì)所誘發(fā)的組氨酸缺陷型(his-)→原養(yǎng)型(his+)回復突變的試驗方法。
3.6 S9
經(jīng)多氯聯(lián)苯(PCB混合物)或苯巴比妥鈉和β-萘黃酮結(jié)合誘導的大鼠制備肝勻漿，在9000g下離心10min后的肝勻漿上清液。
4 原理
鼠傷寒沙門氏組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復突變的細菌生長。假如有致突變物存在，則營養(yǎng)缺陷型的細菌回復突變成原養(yǎng)型，因而能生長形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物�？墒褂帽本﹨R智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司研發(fā)生產(chǎn)的Ames試劑盒，試劑盒省去了培養(yǎng)基成分準備、誘導 S9 制備、菌株 鑒定、菌株培養(yǎng)等時間，可以直接使用，大大縮短了實驗周期。
某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復突變， 故需加入經(jīng)誘導劑誘導的大鼠肝制備的S9混合液。
5 儀器和設備
培養(yǎng)箱、恒溫水浴、振蕩水浴搖床、壓力蒸汽消毒器、干熱烤箱、低溫冰箱(-80℃) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、混勻振蕩器、勻漿器、菌落計數(shù)器、低溫高速離心機，玻璃器皿等。
6 培養(yǎng)基和試劑
6.1 0.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液
成分： L-組氨酸(MW 155) 78mg
D-生物素(MW 244) 122mg
加蒸餾水至 1000mL
配制：將上述成分加熱，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高壓滅菌20min。貯于4℃冰箱。
6.2 頂層瓊脂培養(yǎng)基
成分： 瓊脂粉 1.2g
氯化鈉 1.0g
加蒸餾水至 200mL
配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。實驗時，加入0.5mmol/L組氨酸—0.5mmol/L生物素溶液20mL。
6.3 Vogel-Bonner (V-B) 培養(yǎng)基E
成分：枸椽酸(C6H8O7·H2O) 100g
磷酸氫二鉀(K2HPO4) 500g
磷酸氫銨鈉(NaNH4HPO4·4H2O) 175g
硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 10g
加蒸餾水至 1000mL
配制：先將前三種成分加熱溶解后，再將溶解的硫酸鎂緩緩倒入容量瓶中，加蒸餾水至1000mL。于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。
6.4 20%葡萄糖溶液
成分：葡萄糖 200g
加蒸餾水至 1000mL
配制：加少量蒸餾水加溫溶解葡萄糖，再加蒸餾水至1000mL。于0.068MPa下高壓滅菌20min。儲于4℃冰箱。
6.5 底層瓊脂培養(yǎng)基
成分：瓊脂粉 7.5g
蒸餾水 480mL
V-B培養(yǎng)基E 10mL
20%葡萄糖溶液 10mL
配制：首先將前兩種成分于0.103MPa下高壓滅菌30min后，再加入后兩種成分，充分混勻倒底層平板。按每皿25mL制備平板，冷凝固化后倒置于37℃培養(yǎng)箱中24h，備用。
6.6 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基
成分：牛肉膏 2.5g
胰 胨 5.0g
磷酸氫二鉀(K2HPO4) 1.0g
加蒸餾水至 500mL
配制：將上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。
6.7 鹽溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2)
成分：氯化鉀(KCl) 61.5g
氯化鎂(MgCl2·6H2O) 40.7g
加蒸餾水至 500mL
配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。
6.8 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)
成分：磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O) 2.965g
磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) 29.015g
加蒸餾水至 500mL
配制：溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。
6.9 S9混合液
成分 每毫升S9混合液
肝S9 100ml
鹽溶液 20ml
滅菌蒸餾水 380ml
0.2mol/L磷酸鹽緩沖液 500ml
輔酶II(NADP) 4mmol
6-磷酸葡萄糖(G-6-P) 5mmol
配制：將輔酶II和6-磷酸葡萄糖置于滅菌三角瓶內(nèi)稱重，然后按上述相反的次序加入各種成分， 使肝S9加到已有緩沖液的溶液中。該混合液必須臨用現(xiàn)配，并保存于冰水浴中。實驗結(jié)束，剩余S9混合液應該丟棄。
6.10 菌株鑒定用和特殊用途試劑
6.10.1 組氨酸—生物素平板
成分：瓊脂粉 15g
蒸餾水 944mL
(V-B)培養(yǎng)基E 20mL
20%葡萄糖 20mL
滅菌鹽酸組氨酸水溶液(0.5g/100mL) 10mL
滅菌0.5mmol/L生物素溶液 6mL
配制：高壓滅菌瓊脂和水后，將滅菌20%葡萄糖，V-B培養(yǎng)基和組氨酸溶液加進熱的瓊脂溶液中。待溶液稍為冷卻后，加入滅菌生物素，混勻，澆制平板。
6.10.2 氨芐青霉素平板和氨芐青霉素/四環(huán)素平板
成分：瓊脂粉 15g
蒸餾水 940mL
(V-B)鹽溶液 20mL
20%葡萄糖 20mL
滅菌鹽酸組氨酸溶液（0.5g/100mL） 10mL
滅菌0.5mmol/L生物素溶液 6mL
氨芐青霉素溶液(8mg/mL于0.02mol/LNaOH中) 3.15mL
四環(huán)素溶液(8mg/mL于0.02mol/L HCl中) 0.25mL
配制：瓊脂和水高壓滅菌20min，將無菌的葡萄糖、VB鹽溶液和組氨酸—生物素溶液加進熱的溶液中去，混勻。冷卻至大約50℃，無菌條件下加入四環(huán)素溶液和/或氨芐青霉素溶液。
應該在傾注瓊脂平板后幾天內(nèi)，制備主平板。
6.10.3 營養(yǎng)瓊脂平板
成份：瓊脂粉 7.5g
營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 500mL
配制：于0.103MPa下高壓滅菌30min后傾注平板。
7 試驗菌株及其生物學特性鑒定
7.1 試驗菌株
采用TA97、TA98、TA100和TA102一組標準測試菌株。
7.2 生物學特性鑒定
新獲得的或長期保存的菌種，在試驗前必須進行菌株的生物特性鑒定。菌株鑒定的判斷標準，如表1所示。
表1 試驗菌株鑒定的判斷標準
7.2.1 組氨酸缺陷
原理：組氨酸缺陷型試驗菌株本身不能合成組氨酸，只能在補充組氨酸的培養(yǎng)基上生長，而在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，則不能生長。
鑒定方法：將測試菌株增菌液分別于含組氨酸培養(yǎng)基平板和無組氨酸平板上劃線，于37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷：組氨酸缺陷型菌株在含組氨酸平板上生長，而在無組氨酸平板上則不能生長。
7.2.2 脂多糖屏障缺損
原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一層脂多糖屏障缺損，因此一些大分子物質(zhì)如結(jié)晶紫能穿透菌膜進入菌體，從而抑制其生長，而野生型菌株則不受其影響。
鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，然后將浸濕的0.1%結(jié)晶紫溶液濾紙條與劃線處交叉放置。37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷：假若待測菌在濾紙條與劃線交叉處出現(xiàn)一透明菌帶，說明該待測菌株具有rfa突變。
7.2.3 氨芐青霉素抗性
原理：含R因子的試驗菌株對氨芐青霉素有抗性。因為R因子不太穩(wěn)定，容易丟失，故用氨芐青霉素確定該質(zhì)粒存在與否。
鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL，在氨芐青霉素平板上劃線，37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷；假若測試菌在氨芐青霉素平板上生長，說明該測試菌具有抗氨芐青霉素作用，表示含R因子，否則，表示測試菌不含R因子或R因子丟失。
7.2.4 紫外線敏感性
原理：具有△uvrB突變的菌株對紫外線敏感，當受到紫外線照射后，不能生長，而具有野生型切除修復酶的菌株，則能照常生長。
鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，用黑紙蓋住平板的一半，置紫外燈下照射（15W，距離33cm）8秒鐘。置37℃下孵育24h后觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷：具有△uvrB突變的菌株對紫外線敏感，經(jīng)輻射后細菌不生長，而具有完整的切除修復系統(tǒng)的菌株，則照常生長。
7.2.5 四環(huán)素抗性
原理：具有pAQI的菌株對四環(huán)素有抗性。
鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于氨芐青霉素/四環(huán)素平板上劃線，置37℃下孵育24h后觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷：假若測試菌照常在氨芐青霉素/四環(huán)素平板上生長，表明該測試菌株對氨芐青霉素和四環(huán)素兩者有抗性，具有pAQI質(zhì)粒，否則，說明測試菌株不含pAQI質(zhì)粒。
7.2.6 自發(fā)回變
原理：每種試驗菌株都以一定的頻率自發(fā)地產(chǎn)生回變，稱為自發(fā)回變。這種自發(fā)回變是每種試驗菌株的一項特性。
鑒定方法：將待測菌株增菌液0.1mL加到2mL含組氨酸—生物素的頂層瓊脂培養(yǎng)基的試管內(nèi)，混勻后鋪到于底層瓊脂平板上，待瓊脂固化后，置37℃培養(yǎng)箱中孵育48h后記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。
結(jié)果判斷：每種標準測試菌株的自發(fā)回變菌落數(shù)應符合表1要求。經(jīng)體外代謝活化后的自發(fā)回變菌落數(shù)，要比直接作用下的略高。
7.2.7 回變特性—診斷性試驗
原理：每種試驗菌株對診斷性誘變劑回變作用的性質(zhì)以及S9混合液的效應不一。
鑒定方法：按照平板摻入試驗的操作步驟進行。將受試物換成診斷性誘變劑。
結(jié)果判斷：標準菌株對某些診斷性誘變劑特有的回變結(jié)果參見表2。
表2 測試菌株的回變性
注：inh表示抑菌。表中數(shù)值均已扣除溶劑對照回變菌落數(shù)。
8 大鼠肝微粒體酶的誘導和S9的制備
8.1 誘導
最廣泛應用的大鼠肝微粒體酶的誘導劑是多氯聯(lián)苯（PCB混合物），選擇健康雄性大鼠體重200g左右，一次腹腔注射誘導劑，劑量為500mg/kg體重。誘導劑溶于玉米油中，濃度為200mg/mL。苯巴比妥鈉和β-萘黃酮結(jié)合也可做為誘導劑。
上述全部操作均在冰水浴中和無菌條件下進行。制備肝S9所用一切手術(shù)器械、器皿等，均經(jīng)滅菌消毒。S9制備后，其活力需經(jīng)診斷性誘變劑進行鑒定。
9 溶劑的選擇
如果受試物為水溶性，可用滅菌蒸餾水作為溶劑；如為脂溶性，應選擇對試驗菌株毒性低且無致突變性的有機溶劑，常用的有二甲基亞砜（DMSO）、丙酮、95%乙醇。一般操作中，為了減少誤差和溶劑的影響，常按每皿使用劑量用同一溶劑配成不同的濃度，固定加入量為100ml。
10 劑量的設計
決定受試物最高劑量的標準是對細菌的毒性及其溶解度。自發(fā)回變數(shù)的減少，背景菌變得清晰或被處理的培養(yǎng)物細菌存活數(shù)減少，都是毒性的標志。
對原料而言，一般最高劑量組可為5mg/皿。對產(chǎn)品而言，有殺菌作用的受試物，最高劑量可為最低抑菌濃度，無殺菌作用的受試物，最高劑量可為原液。受試物至少應設四個劑量組。每個劑量均做三個平行平板。
11 試驗操作步驟
11.1 增菌培養(yǎng)
取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5mL，加入無菌試管中，將主平板或冷凍保存的菌株培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩（100次/min）培養(yǎng)10h。該菌株培養(yǎng)物應每毫升不少于1～2×109活菌數(shù)。
11.2 平板摻入法
實驗時，將含0.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液的頂層瓊脂培養(yǎng)基2.0mL分裝于試管中，45℃水浴中保溫，然后每管依次加入試驗菌株增菌液0.1mL，受試物溶液0.1mL和S9混合液0.5mL（需代謝活化時），充分混勻，迅速傾入底層瓊脂平板上，轉(zhuǎn)動平板，使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后，倒置于37℃培養(yǎng)箱里孵育48h。記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。
實驗中，除設受試物各劑量組外，還應同時設空白對照、溶劑對照、陽性誘變劑對照和無菌對照。
12 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷
記錄受試物各劑量組、空白對照（自發(fā)回變）、溶劑對照以及陽性誘變劑對照的每皿回變菌落數(shù)，并求平均值和標準差。
如果受試物的回變菌落數(shù)是溶劑對照回變菌落數(shù)的兩倍或兩倍以上，并呈劑量-反應關(guān)系者，則該受試物判定為致突變陽性。
受試物經(jīng)上述四個試驗菌株測定后，只要有一個試驗菌株，無論在加S9或未加S9條件下為陽性，均可報告該受試物對鼠傷寒沙門氏菌為致突變陽性。如果受試物經(jīng)四個試驗菌株檢測后，無論加S9和未加S9均為陰性，則可報告該受試物為致突變陰性。
13 試驗報告
試驗報告應包括以下內(nèi)容：
（1）受試物名稱、理化性狀、配制方法、使用溶劑；
（2）試驗菌株：所用試驗菌株；
（3）代謝活化系統(tǒng)：所用誘導劑；
（4）試驗方法：簡述操作步驟，除受試物劑量分組外，還應說明空白對照、溶劑對照和陽性對照，
陽性結(jié)果判定標準；
（5）結(jié)果：以列表方式報告受試物的Ames實驗結(jié)果（表1）；
（6）結(jié)論。
表1 Ames試驗菌株的回變結(jié)果（平均值±標準差）
Ames試劑盒
北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司針對Ames試驗開發(fā)Ames試劑盒， 本試劑盒省去了培養(yǎng)基成分準備、誘導 S9 制備、菌株 鑒定、菌株培養(yǎng)等時間，可以直接使用，大大縮短了實驗周期；試劑盒各成分均經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，無雜菌污染，菌株特性與活菌數(shù)目以及誘導 S9 活性均符合 Ames 試驗要求，實驗結(jié)果準確、可靠、重現(xiàn)性高。Ames試劑盒應用廣泛，可進行食品與飲用水、化學品、洗滌劑、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝材料等多個方面的遺傳毒理學檢測。
1. 誘導 S9 采用國際先進無菌凍干干燥工藝制成，實現(xiàn)了誘導 S9 酶活性的穩(wěn)定保存，同時有效防止了細菌污染。實驗時用 S9 反 應液溶解混勻。
2. 實驗菌株采用先進工藝規(guī)模化制備，出廠前經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，低溫貯存條件確保了實驗菌株的長期穩(wěn)定性。實驗時混 勻后即可直接使用，節(jié)省了菌株鑒定、活化處理以及菌液濃度調(diào)整等時間。
3. 實驗陽性對照試劑種類覆蓋整個 Ames 實驗要求，在添加和不添加 S9 的情況下均可以誘導實驗菌株呈現(xiàn)陽性反應。陽性對照 試劑采購自國際大品牌公司，按照 Ames 實驗需求精準定量分 裝，出廠前經(jīng)過實驗檢測，陽性對照試劑的長期穩(wěn)定性有質(zhì)量 保證。
4. 底層培養(yǎng)基 VS、GS 以干粉形式提供，便于培養(yǎng)基長期穩(wěn)定 保存。使用前只需添加蒸餾水滅菌處理即可，試劑瓶采用耐高 溫材料，因此可以直接向試劑瓶中添加所需劑量的蒸餾水。
5. 頂層培養(yǎng)基 HB 凍干球采用先進無菌凍干干燥工藝制成，使用前需先用滅菌蒸餾水溶解，然后用 0.22μm 濾膜過濾除菌。
試劑盒應用范圍
本試劑盒應用范圍非常廣，可進行食品與飲用水、化學品、洗滌劑、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝 材料等遺傳毒理學檢測。
傳統(tǒng)實驗操作不足
周期長——培養(yǎng)基成分準備、誘導 S9 制備、菌株鑒定、菌株培養(yǎng) 等耗費大量時間。 穩(wěn)定性差——雜菌污染、活菌數(shù)不符合要求、實驗試劑配制不準 確等都會導致實驗失敗。
試劑盒優(yōu)勢
便捷—— 本試劑盒省去了培養(yǎng)基成分準備、誘導 S9 制備、菌株 鑒定、菌株培養(yǎng)等時間，可以直接使用，大大縮短了實驗周期。 準確——本試劑盒各成分均經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，無雜菌污染， 菌株特性與活菌數(shù)目以及誘導 S9 活性均符合 Ames 試驗要求，實 驗結(jié)果準確、可靠、重現(xiàn)性高。
穩(wěn)定—— 本試劑盒穩(wěn)定性強、易于運輸和保存。
試劑盒使用操作流程
1. 實驗器材、試劑準備：三角瓶、5mL 或 15mL 試管、100μl 和1000μl 槍頭、0.22μm 濾膜、注射器、平皿、二甲基亞砜、滅菌 蒸餾水等；
2. 設置待測物劑量，配制各劑量無菌待測物溶液；
3. VS、GS 培養(yǎng)基加水溶解并滅菌，配制底層培養(yǎng)基；
4. HB 球加滅菌蒸餾水溶解，充分混勻，然后過濾除菌；
5. 實驗當天配制頂層培養(yǎng)基，2ml 分裝，然后 45℃水浴保溫；
6. 用無菌蒸餾水溶解 S9 復合物并配制 S9 反應混合液；
7. 開展 Ames 實驗，將 2mL 頂層培養(yǎng)基+100μL 菌液+100μL 待測 物或陽性底物+500μL10% S9 混合液混勻，傾倒于底層培養(yǎng)基（實驗室溫度低時傾倒的頂層培養(yǎng)基易冷凝，可將底層培養(yǎng)基 放置于 37℃培養(yǎng)箱一段時間，然后再傾倒頂層培養(yǎng)基）；
8. 待頂層培養(yǎng)基冷凝后，將實驗平皿放入 37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng) 48h后觀察實驗結(jié)果；
試驗方法
試驗方法主要是平板摻入法和預培養(yǎng)平板摻入法，具體操作如下：
1. 平板摻入法
a) 準備所需底層培養(yǎng)基平皿若干。
b) 融化頂層培養(yǎng)基分裝于無菌小試管，每管2 mL，在45℃水 浴中保溫。
c) 在保溫的頂層培養(yǎng)基中依次加入測試菌株菌液0.1 mL，混 勻；加受試物0.05 mL~ 0.2 mL（一般加入0.1 mL。需活化時 另外再加入10 % S9反應混合液 0.5 mL），再混勻，然后迅 速傾入底層培養(yǎng)基上。轉(zhuǎn)動平皿，使頂層培養(yǎng)基均勻分布 在底層上，平放固化，37℃ 培養(yǎng) 48 h觀察結(jié)果。
d) 另做一陽性對照、溶劑對照和未處理對照。陽性對照不加 受試物，只加標準誘變劑（即試劑盒陽性對照試劑，見表2）；溶劑對照加除受試物和標準誘變劑以外的所有試劑， 如溶劑二甲基亞砜等（光譜純或分析純）；未處理對照只 在培養(yǎng)基上加菌液；其他方法同上。
2. 預培養(yǎng)平板摻入法 預培養(yǎng)對于某些受試物可取得較好效果。因此可根據(jù)情況確定 是否進行預培養(yǎng)。在加入頂層瓊脂前，先進行以下預培養(yǎng)步
驟：在試驗中，將受試物（需活化時另加入10% S9反應混合 液）和菌液，在37℃中培養(yǎng)20min，或在30℃中培養(yǎng)30min，然 后再加2mL頂層瓊脂，其他同上述平板摻入法。
試驗設計及受試物的特殊處理
1) 劑量設計 決定受試物最高劑量的原則是受試物對試驗菌株的毒性和受試物的溶解度。對于純的化學物質(zhì)，一般最低劑量為每平皿0.2 μg，最高劑量為 5 mg，或溶解度允許，或飽和濃度，或?qū)毦a(chǎn)生最小毒性濃度。對于毒性很低、攝入量很大的定型產(chǎn)品，可根據(jù)其溶解度和對細菌的毒性采用可能的最大劑量。每 種受試物在允許最高劑量下設4個（含4個）以上劑量，每劑量間隔不超過5倍，每個劑量應做三個平皿。
2) 溶劑 溶劑可選用水、二甲基亞砜或其他溶劑（溶劑劑量應限定在毒性劑量以下。以二甲基亞砜為例，平板摻入法每皿不超過0.1mL 溶劑；預培養(yǎng)平板摻入法每皿不超過0.01mL 溶劑）， 無論選用什么溶劑均應無誘變性。
3) 對照組的設置 試驗應同時設有陽性物對照組、溶劑對照組和未處理對照，均 包括加S9和不加S9兩種情況。
4) 受試物的特殊處理 若遇特殊受試物作非常規(guī)處理時應在報告中說明。對以下幾種情況可作如下處理：
a) 含組氨酸受試物：根據(jù)食品中測得的組氨酸含量若能誘發(fā) 回復突變率的增高可加設組氨酸平行對照組；或?qū)z品經(jīng)XAD-II樹脂柱過濾洗脫預處理。
b) 食品包裝材料及其制品成分：根據(jù)材料或制品的組成成 分，可分別采取過篩抽提、蒸發(fā)殘渣等技術(shù)處理。
c) 揮發(fā)性受試物：可采用真空干燥器處理等方法。
d) 天然植物材料：可按植物化學方法制備粗制品或純制品。
結(jié)果的判定
以直接計數(shù)培養(yǎng)基上長出回變菌落數(shù)的多少而定，如在背景生 長良好條件下，受試物組回變菌落數(shù)是溶劑對照回變菌落數(shù)的 兩倍或兩倍以上，并有劑量反應關(guān)系或至少某一測試點有可重 復的并有統(tǒng)計學意義的陽性反應，即可認為該受試物誘變試驗 陽性。受試物經(jīng)上述四個試驗菌株測定后，只要有一個試驗菌 株，無論在加S9或未加S9條件下為陽性，均可報告該受試物對 鼠傷寒沙門氏菌為致突變陽性。如果受試物經(jīng)四個試驗菌株檢 測后，無論加S9和未加S9均為陰性，則可報告該受試物為致突 變陰性。
Ames 實驗報道文獻舉例
廣東省疾病預防控制中心通過 Ames 試驗發(fā)現(xiàn)部分染發(fā)劑引起試驗 菌株 TA97、TA98、TA100 回變率明顯升高，提示部分染發(fā)類 產(chǎn)品具有致突變作用，可對健康產(chǎn)生危害。何冬梅等、中 國 衛(wèi) 生檢驗雜志 2007,17,(11)。
人參與女貞子是臨床上常見的有一定抗腫瘤效果的補益中藥，在 Ames 試驗中人參能抑制二氨基芴引起的 TA98 菌株回變菌落數(shù)的增加；女貞子能抑制疊氮鈉引起的 TA100 菌株回變菌落數(shù)的增加，分別表現(xiàn)出抗移碼型突變和抗堿基置換型突變的作用。倪婭等、中國保健 2009,17,(17)。生活飲用水經(jīng)投加二氧化氯處理后對水中石油類污染物具有較 強的去除作用，可使水中有毒有害有致癌性的物質(zhì)氧化降解為 毒性較小、無致癌作用的小分子物質(zhì)，并且致突變活性明顯降低，Ames 值由陽性轉(zhuǎn)為陰性。高慶然等、工業(yè)用水與廢水2001,6。
喹烯酮是我國自主研發(fā)的喹噁啉類一類新獸藥，作為抗菌促生 長劑用于豬飼料中， Ames 試驗表明喹烯酮對 TA97、TA98、 TA100 和 TA1537 加和不加 S9 在一定劑量下均為陽性。結(jié)果提 示，喹烯酮存在一定致突變毒性，應制定最高殘留限量。張偉 等、毒理學雜志 2007,04。
Ames 試驗表明煤和液化石油氣（LPG）燃燒顆粒物均具有很強 的直接和間接致突變作用，主要致突變作用來源于硝基和胺基多環(huán)芳烴，兩種顆粒物同時存在可加大致癌風險。閆洪濤等、 中國公共衛(wèi)生 2007,04。
烷基酚聚氧乙烯醚（APES） 是一大類表面活性劑家族，廣泛 用于家庭和工業(yè)的清潔產(chǎn)品，烷基酚類化合物是其降解產(chǎn)物， 其中對甲基苯酚、2,6-二甲基苯酚、4-乙基苯酚、4-辛基苯酚、對壬基苯酚、4-硝基苯酚、2-氯苯酚、1,3-二氯苯酚、2,4-二氯 苯酚、2,6-二氯苯酚、三氯苯酚和 2,3,5,6-四氯苯酚 12 種化合物 的 Ames 試驗表明除 2,4- 二氯苯酚未誘發(fā)各菌株的陽性反應外，其余 11 種待測物均誘發(fā)了陽性反應,說明這 11 種苯酚類化 合物均具有致突變性。楊麗等、東北師大學報（自然科學版）
2003,01。
重組葡糖激酶作為一種生物技術(shù)藥物具有明顯的溶栓和抗凝效果，Ames 實驗結(jié)果顯示重組葡糖激酶對試驗菌株 TA97 、TA98、TA100 和 TA102 無誘發(fā)回變作用。劉永學等、癌變·畸變·突變 2004,9。
常見問題及原因分析
1、自發(fā)回變數(shù)顯著低于標準 原因：a. 試劑盒保存條件不合適，菌株失活或營養(yǎng)成分降解；b.培養(yǎng)基配制操作過程中組氨酸、生物素添加量低；c.操作過程中添加菌液時頂層培養(yǎng)基溫度過高；
2、自發(fā)回變數(shù)顯著高于標準 原因：a. 培養(yǎng)基配制操作過程中組氨酸、生物素添加量高；b.培養(yǎng)皿經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒不徹底或環(huán)氧乙烷有殘留；
3、陽性底物誘變菌落數(shù)偏離標準范圍 原因：a. 陽性底物溶解不徹底或未充分混勻；b. 陽性底物添加量不準確；c. 試劑盒保存條件不合適或過期，陽性底物降解或 S9失活；d. 操作過程中添加菌液時頂層培養(yǎng)基溫度過高；
4、待測物誘變菌落數(shù)非常低或沒有菌落 原因：a. 待測物或待測物溶劑對細菌生長有毒性；b. 試劑盒保存條件不合適或過期，陽性底物降解或 S9 失活； c. 操作過程中添加菌液時頂層培養(yǎng)基溫度過高；
5、菌落分布不均勻，集中偏向一側(cè)。原因： 倒底層或頂層培養(yǎng)基時平皿未水平放置；
6、頂層或底層培養(yǎng)基凝固不充分或滑出平皿 原因：a. 頂層或底層培養(yǎng)基中瓊脂粉含量低；b. 頂層培養(yǎng)基中加入的溶劑或待測物酸化，導致凝膠不充分；
7、如何判斷 Ames 實驗結(jié)果是否為假陽性 將經(jīng)受試物和陽性對照物處理的 Ames 菌落進行增菌培養(yǎng)后接種于無組氨酸的培養(yǎng)基上,觀察比較細菌的生長情況。如果經(jīng)受試 物處理的菌株不能生長在無組氨酸的培養(yǎng)基中,而經(jīng)陽性對照物處 理的菌株則可以生長在無組氨酸的培養(yǎng)基上,則說明經(jīng)受試物處理 的菌株沒有發(fā)生突變，試驗中所觀察到的菌落數(shù)增加是假陽性。
Ames 試驗原理
Ames 試驗利用鼠傷寒沙門氏組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，該缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復突變的細菌生長；假如有致突變物存在，則營養(yǎng)缺陷型的細菌誘導回復突變成原養(yǎng)型，因而能生長形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物。某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復突變， 故需加入經(jīng)誘導劑誘導的大鼠肝制備的 S9混合液。北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司針對Ames試驗開發(fā)Ames試劑盒， 本試劑盒省去了培養(yǎng)基成分準備、誘導 S9 制備、菌株 鑒定、菌株培養(yǎng)等時間，可以直接使用，大大縮短了實驗周期；試劑盒各成分均經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，無雜菌污染，菌株特性與活菌數(shù)目以及誘導 S9 活性均符合 Ames 試驗要求，實驗結(jié)果準確、可靠、重現(xiàn)性高。Ames試劑盒應用廣泛，可進行食品與飲用水、化學品、洗滌劑、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝材料等多個方面的遺傳毒理學檢測。
Ames試驗導則
1 范圍
本規(guī)范確定了鼠傷寒沙門氏菌／回復突變試驗的基本原則、要求和方法。
本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品的基因突變檢測。
2 規(guī)范性引用文件
OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No.471,Adopted:21,July 1997)。
3 定義
3.1 回復突變（Reverse mutation）
細菌在化學致突變物作用下由營養(yǎng)缺陷型回變到原養(yǎng)型(prototroph)。
3.2 基因突變 （Gene mutation）
在化學致突變物作用下細胞DNA中堿基對的排列順序發(fā)生變化。
3.3 堿基置換突變 （Base substitution mutation）
引起DNA鏈上一個或幾個堿基對的置換。
堿基置換有轉(zhuǎn)換(transition)和顛換(transversion)兩種形式。
轉(zhuǎn)換是DNA鏈上的一個嘧啶被另一嘧啶所替代，或一個嘌呤被另一嘌呤所代替。
顛換是DNA鏈上的一個嘧啶被另一嘌呤所替代，或一個嘌呤被另一嘧啶所代替。
3.4 移碼突變（ Frameshift mutation）
引起DNA鏈上增加或缺失一個或多個堿基對。
3.5 鼠傷寒沙門氏菌/回復突變試驗（ Salmonella typhimurium/reverse mutation assay）
利用一組鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型試驗菌株測定引起沙門氏菌堿基置換或移碼突變的化學物質(zhì)所誘發(fā)的組氨酸缺陷型(his-)→原養(yǎng)型(his+)回復突變的試驗方法。
3.6 S9
經(jīng)多氯聯(lián)苯(PCB混合物)或苯巴比妥鈉和β-萘黃酮結(jié)合誘導的大鼠制備肝勻漿，在9000g下離心10min后的肝勻漿上清液。
4 原理
鼠傷寒沙門氏組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復突變的細菌生長。假如有致突變物存在，則營養(yǎng)缺陷型的細菌回復突變成原養(yǎng)型，因而能生長形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物�？墒褂帽本﹨R智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司研發(fā)生產(chǎn)的Ames試劑盒，試劑盒省去了培養(yǎng)基成分準備、誘導 S9 制備、菌株 鑒定、菌株培養(yǎng)等時間，可以直接使用，大大縮短了實驗周期。
某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復突變， 故需加入經(jīng)誘導劑誘導的大鼠肝制備的S9混合液。
5 儀器和設備
培養(yǎng)箱、恒溫水浴、振蕩水浴搖床、壓力蒸汽消毒器、干熱烤箱、低溫冰箱(-80℃) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、混勻振蕩器、勻漿器、菌落計數(shù)器、低溫高速離心機，玻璃器皿等。
6 培養(yǎng)基和試劑
6.1 0.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液
成分： L-組氨酸(MW 155) 78mg
D-生物素(MW 244) 122mg
加蒸餾水至 1000mL
配制：將上述成分加熱，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高壓滅菌20min。貯于4℃冰箱。
6.2 頂層瓊脂培養(yǎng)基
成分： 瓊脂粉 1.2g
氯化鈉 1.0g
加蒸餾水至 200mL
配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。實驗時，加入0.5mmol/L組氨酸—0.5mmol/L生物素溶液20mL。
6.3 Vogel-Bonner (V-B) 培養(yǎng)基E
成分：枸椽酸(C6H8O7·H2O) 100g
磷酸氫二鉀(K2HPO4) 500g
磷酸氫銨鈉(NaNH4HPO4·4H2O) 175g
硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 10g
加蒸餾水至 1000mL
配制：先將前三種成分加熱溶解后，再將溶解的硫酸鎂緩緩倒入容量瓶中，加蒸餾水至1000mL。于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。
6.4 20%葡萄糖溶液
成分：葡萄糖 200g
加蒸餾水至 1000mL
配制：加少量蒸餾水加溫溶解葡萄糖，再加蒸餾水至1000mL。于0.068MPa下高壓滅菌20min。儲于4℃冰箱。
6.5 底層瓊脂培養(yǎng)基
成分：瓊脂粉 7.5g
蒸餾水 480mL
V-B培養(yǎng)基E 10mL
20%葡萄糖溶液 10mL
配制：首先將前兩種成分于0.103MPa下高壓滅菌30min后，再加入后兩種成分，充分混勻倒底層平板。按每皿25mL制備平板，冷凝固化后倒置于37℃培養(yǎng)箱中24h，備用。
6.6 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基
成分：牛肉膏 2.5g
胰 胨 5.0g
磷酸氫二鉀(K2HPO4) 1.0g
加蒸餾水至 500mL
配制：將上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。
6.7 鹽溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2)
成分：氯化鉀(KCl) 61.5g
氯化鎂(MgCl2·6H2O) 40.7g
加蒸餾水至 500mL
配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。
6.8 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)
成分：磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O) 2.965g
磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) 29.015g
加蒸餾水至 500mL
配制：溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。
6.9 S9混合液
成分 每毫升S9混合液
肝S9 100ml
鹽溶液 20ml
滅菌蒸餾水 380ml
0.2mol/L磷酸鹽緩沖液 500ml
輔酶II(NADP) 4mmol
6-磷酸葡萄糖(G-6-P) 5mmol
配制：將輔酶II和6-磷酸葡萄糖置于滅菌三角瓶內(nèi)稱重，然后按上述相反的次序加入各種成分， 使肝S9加到已有緩沖液的溶液中。該混合液必須臨用現(xiàn)配，并保存于冰水浴中。實驗結(jié)束，剩余S9混合液應該丟棄。
6.10 菌株鑒定用和特殊用途試劑
6.10.1 組氨酸—生物素平板
成分：瓊脂粉 15g
蒸餾水 944mL
(V-B)培養(yǎng)基E 20mL
20%葡萄糖 20mL
滅菌鹽酸組氨酸水溶液(0.5g/100mL) 10mL
滅菌0.5mmol/L生物素溶液 6mL
配制：高壓滅菌瓊脂和水后，將滅菌20%葡萄糖，V-B培養(yǎng)基和組氨酸溶液加進熱的瓊脂溶液中。待溶液稍為冷卻后，加入滅菌生物素，混勻，澆制平板。
6.10.2 氨芐青霉素平板和氨芐青霉素/四環(huán)素平板
成分：瓊脂粉 15g
蒸餾水 940mL
(V-B)鹽溶液 20mL
20%葡萄糖 20mL
滅菌鹽酸組氨酸溶液（0.5g/100mL） 10mL
滅菌0.5mmol/L生物素溶液 6mL
氨芐青霉素溶液(8mg/mL于0.02mol/LNaOH中) 3.15mL
四環(huán)素溶液(8mg/mL于0.02mol/L HCl中) 0.25mL
配制：瓊脂和水高壓滅菌20min，將無菌的葡萄糖、VB鹽溶液和組氨酸—生物素溶液加進熱的溶液中去，混勻。冷卻至大約50℃，無菌條件下加入四環(huán)素溶液和/或氨芐青霉素溶液。
應該在傾注瓊脂平板后幾天內(nèi)，制備主平板。
6.10.3 營養(yǎng)瓊脂平板
成份：瓊脂粉 7.5g
營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 500mL
配制：于0.103MPa下高壓滅菌30min后傾注平板。
7 試驗菌株及其生物學特性鑒定
7.1 試驗菌株
采用TA97、TA98、TA100和TA102一組標準測試菌株。
7.2 生物學特性鑒定
新獲得的或長期保存的菌種，在試驗前必須進行菌株的生物特性鑒定。菌株鑒定的判斷標準，如表1所示。
表1 試驗菌株鑒定的判斷標準
| 菌株 | 組氨酸 缺陷 |
脂多糖屏障缺損 | 氨芐青霉素抗性 | 切除修復缺損 | 四環(huán)素 抗性 |
自發(fā)回變菌落數(shù)* |
| TA97 TA98 TA100 TA102 |
+ + + + |
+ + + + |
+ + + + |
+ + + - |
- - - + |
90-180 30-50 100-200 240-320 |
| 注 | “+”表示需要組氨酸 | “+”表示具有rfa突變 | “+”表示具有R因子 | “+”表示具有△uvrB突變 | “+”表示具有pAQ1質(zhì)粒 | *在體外代謝活化條件下自發(fā)回變菌落數(shù)略增 |
7.2.1 組氨酸缺陷
原理：組氨酸缺陷型試驗菌株本身不能合成組氨酸，只能在補充組氨酸的培養(yǎng)基上生長，而在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，則不能生長。
鑒定方法：將測試菌株增菌液分別于含組氨酸培養(yǎng)基平板和無組氨酸平板上劃線，于37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷：組氨酸缺陷型菌株在含組氨酸平板上生長，而在無組氨酸平板上則不能生長。
7.2.2 脂多糖屏障缺損
原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一層脂多糖屏障缺損，因此一些大分子物質(zhì)如結(jié)晶紫能穿透菌膜進入菌體，從而抑制其生長，而野生型菌株則不受其影響。
鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，然后將浸濕的0.1%結(jié)晶紫溶液濾紙條與劃線處交叉放置。37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷：假若待測菌在濾紙條與劃線交叉處出現(xiàn)一透明菌帶，說明該待測菌株具有rfa突變。
7.2.3 氨芐青霉素抗性
原理：含R因子的試驗菌株對氨芐青霉素有抗性。因為R因子不太穩(wěn)定，容易丟失，故用氨芐青霉素確定該質(zhì)粒存在與否。
鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL，在氨芐青霉素平板上劃線，37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷；假若測試菌在氨芐青霉素平板上生長，說明該測試菌具有抗氨芐青霉素作用，表示含R因子，否則，表示測試菌不含R因子或R因子丟失。
7.2.4 紫外線敏感性
原理：具有△uvrB突變的菌株對紫外線敏感，當受到紫外線照射后，不能生長，而具有野生型切除修復酶的菌株，則能照常生長。
鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，用黑紙蓋住平板的一半，置紫外燈下照射（15W，距離33cm）8秒鐘。置37℃下孵育24h后觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷：具有△uvrB突變的菌株對紫外線敏感，經(jīng)輻射后細菌不生長，而具有完整的切除修復系統(tǒng)的菌株，則照常生長。
7.2.5 四環(huán)素抗性
原理：具有pAQI的菌株對四環(huán)素有抗性。
鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于氨芐青霉素/四環(huán)素平板上劃線，置37℃下孵育24h后觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷：假若測試菌照常在氨芐青霉素/四環(huán)素平板上生長，表明該測試菌株對氨芐青霉素和四環(huán)素兩者有抗性，具有pAQI質(zhì)粒，否則，說明測試菌株不含pAQI質(zhì)粒。
7.2.6 自發(fā)回變
原理：每種試驗菌株都以一定的頻率自發(fā)地產(chǎn)生回變，稱為自發(fā)回變。這種自發(fā)回變是每種試驗菌株的一項特性。
鑒定方法：將待測菌株增菌液0.1mL加到2mL含組氨酸—生物素的頂層瓊脂培養(yǎng)基的試管內(nèi)，混勻后鋪到于底層瓊脂平板上，待瓊脂固化后，置37℃培養(yǎng)箱中孵育48h后記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。
結(jié)果判斷：每種標準測試菌株的自發(fā)回變菌落數(shù)應符合表1要求。經(jīng)體外代謝活化后的自發(fā)回變菌落數(shù)，要比直接作用下的略高。
7.2.7 回變特性—診斷性試驗
原理：每種試驗菌株對診斷性誘變劑回變作用的性質(zhì)以及S9混合液的效應不一。
鑒定方法：按照平板摻入試驗的操作步驟進行。將受試物換成診斷性誘變劑。
結(jié)果判斷：標準菌株對某些診斷性誘變劑特有的回變結(jié)果參見表2。
表2 測試菌株的回變性
| 誘變劑 | 劑量(mg) | S9 | TA97 | TA98 | TA100 | TA102 |
| 柔毛霉素 疊氮化鈉 ICR—191 鏈霉黑素 絲裂霉素C 2,4,7-三硝基-9-芴酮 4-硝基-O-次苯二胺 4-硝基喹啉-N-氧化物 甲基磺酸甲酯 2-氨基芴 苯并（a）芘 |
6.0 1.5 1.0 0.25 0.5 0.20 20 0.5 1.0 10 1.0 |
- - - - - - - - - + + |
124 76 1640 inh inh 8377 2160 528 174 1742 337 |
3123 3 63 inh inh 8244 1599 292 23 6194 143 |
47 3000 185 inh inh 400 798 4220 2730 3026 937 |
592 188 0 2230 2772 16 0 287 6586 261 255 |
8 大鼠肝微粒體酶的誘導和S9的制備
8.1 誘導
最廣泛應用的大鼠肝微粒體酶的誘導劑是多氯聯(lián)苯（PCB混合物），選擇健康雄性大鼠體重200g左右，一次腹腔注射誘導劑，劑量為500mg/kg體重。誘導劑溶于玉米油中，濃度為200mg/mL。苯巴比妥鈉和β-萘黃酮結(jié)合也可做為誘導劑。
- S9制備
上述全部操作均在冰水浴中和無菌條件下進行。制備肝S9所用一切手術(shù)器械、器皿等，均經(jīng)滅菌消毒。S9制備后，其活力需經(jīng)診斷性誘變劑進行鑒定。
9 溶劑的選擇
如果受試物為水溶性，可用滅菌蒸餾水作為溶劑；如為脂溶性，應選擇對試驗菌株毒性低且無致突變性的有機溶劑，常用的有二甲基亞砜（DMSO）、丙酮、95%乙醇。一般操作中，為了減少誤差和溶劑的影響，常按每皿使用劑量用同一溶劑配成不同的濃度，固定加入量為100ml。
10 劑量的設計
決定受試物最高劑量的標準是對細菌的毒性及其溶解度。自發(fā)回變數(shù)的減少，背景菌變得清晰或被處理的培養(yǎng)物細菌存活數(shù)減少，都是毒性的標志。
對原料而言，一般最高劑量組可為5mg/皿。對產(chǎn)品而言，有殺菌作用的受試物，最高劑量可為最低抑菌濃度，無殺菌作用的受試物，最高劑量可為原液。受試物至少應設四個劑量組。每個劑量均做三個平行平板。
11 試驗操作步驟
11.1 增菌培養(yǎng)
取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5mL，加入無菌試管中，將主平板或冷凍保存的菌株培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩（100次/min）培養(yǎng)10h。該菌株培養(yǎng)物應每毫升不少于1～2×109活菌數(shù)。
11.2 平板摻入法
實驗時，將含0.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液的頂層瓊脂培養(yǎng)基2.0mL分裝于試管中，45℃水浴中保溫，然后每管依次加入試驗菌株增菌液0.1mL，受試物溶液0.1mL和S9混合液0.5mL（需代謝活化時），充分混勻，迅速傾入底層瓊脂平板上，轉(zhuǎn)動平板，使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后，倒置于37℃培養(yǎng)箱里孵育48h。記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。
實驗中，除設受試物各劑量組外，還應同時設空白對照、溶劑對照、陽性誘變劑對照和無菌對照。
12 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷
記錄受試物各劑量組、空白對照（自發(fā)回變）、溶劑對照以及陽性誘變劑對照的每皿回變菌落數(shù)，并求平均值和標準差。
如果受試物的回變菌落數(shù)是溶劑對照回變菌落數(shù)的兩倍或兩倍以上，并呈劑量-反應關(guān)系者，則該受試物判定為致突變陽性。
受試物經(jīng)上述四個試驗菌株測定后，只要有一個試驗菌株，無論在加S9或未加S9條件下為陽性，均可報告該受試物對鼠傷寒沙門氏菌為致突變陽性。如果受試物經(jīng)四個試驗菌株檢測后，無論加S9和未加S9均為陰性，則可報告該受試物為致突變陰性。
13 試驗報告
試驗報告應包括以下內(nèi)容：
（1）受試物名稱、理化性狀、配制方法、使用溶劑；
（2）試驗菌株：所用試驗菌株；
（3）代謝活化系統(tǒng)：所用誘導劑；
（4）試驗方法：簡述操作步驟，除受試物劑量分組外，還應說明空白對照、溶劑對照和陽性對照，
陽性結(jié)果判定標準；
（5）結(jié)果：以列表方式報告受試物的Ames實驗結(jié)果（表1）；
（6）結(jié)論。
表1 Ames試驗菌株的回變結(jié)果（平均值±標準差）
| 組別 | 劑量 (mg/皿) |
TA97 -( S9) +( S9) |
TA98 -( S9) +( S9) |
TA100 -( S9) +( S9) |
TA102    -( S9) +( S9) |
| 受試物 | |||||
| 自發(fā)回變 | |||||
| 溶劑對照 | |||||
| 陽性物對照 |
Ames試劑盒
北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司針對Ames試驗開發(fā)Ames試劑盒， 本試劑盒省去了培養(yǎng)基成分準備、誘導 S9 制備、菌株 鑒定、菌株培養(yǎng)等時間，可以直接使用，大大縮短了實驗周期；試劑盒各成分均經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，無雜菌污染，菌株特性與活菌數(shù)目以及誘導 S9 活性均符合 Ames 試驗要求，實驗結(jié)果準確、可靠、重現(xiàn)性高。Ames試劑盒應用廣泛，可進行食品與飲用水、化學品、洗滌劑、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝材料等多個方面的遺傳毒理學檢測。
| 包裝盒 | 產(chǎn)品組成 | v5.1（4菌） | V5.2（5菌） | 使用說明 | 保存條件 | ||
| 規(guī)格 | 數(shù)量 | 規(guī)格 | 數(shù)量 | ||||
| A盒 | 瓊脂粉Agar | 66g | 1 | 80g | 1 | 室溫 |
|
| 底層培養(yǎng)基GS | 100mL | 1 | 100mL | 1 | 使用前混勻 | ||
| 氯化鈉 | 3g | 1 | 3g | 1 | |||
| 2-氨基芴 | 1mL | 1 | 1mL | 1 | 200μg/mL，使用前混勻 | ||
| 甲基磺酸甲酯 | 1mL | 1 | 1mL | 1 | 使用前加1 mL滅菌蒸餾水混勻，濃度10μL/mL | ||
| 敵克松 | 1mL | 1 | 1mL | 1 | 500μg/mL，使用前混勻 | ||
| 疊氮鈉 | / | / | 0.5mL | 1 | 15μg/mL，使用前混勻 | ||
| 2-氨基蒽 | / | / | 0.5mL | 1 | 20μg/mL，使用前混勻 | ||
| S9反應液 | 42mL | 1 | 42mL | 1 | 使用前混勻 | ||
| 底層培養(yǎng)基VS | 100mL | 1 | 100mL | 1 | 使用前混勻 | ||
| B盒 | HB溶液 | 2.5mL | 1 | 2.5mL | 1 | 使用前混勻 | -80℃下長期保存，可保存6個月。-20℃可短期保存3周。請勿反復凍融。 |
| 1,8-二羥基蒽醌 | 0.5mL | 1 | 0.5mL | 1 | 1mg/mL，使用前混勻 | ||
| S9 混合物 | 1.4mL | 5 | 1.4mL | 6 | 使用前加2.86 mL冰冷滅菌蒸餾水復溶 | ||
| TA97菌株 | 5.0mL | 1 | 5.0mL | 1 | 使用前混勻 | ||
| TA98菌株 | 5.0mL | 1 | 5.0mL | 1 | |||
| TA100菌株 | 5.0mL | 1 | 5.0mL | 1 | |||
| TA102菌株 | 5.0mL | 1 | 5.0mL | 1 | |||
| TA1535菌株 | / | / | 5.0mL | 1 | |||
1. 誘導 S9 采用國際先進無菌凍干干燥工藝制成，實現(xiàn)了誘導 S9 酶活性的穩(wěn)定保存，同時有效防止了細菌污染。實驗時用 S9 反 應液溶解混勻。
2. 實驗菌株采用先進工藝規(guī)模化制備，出廠前經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，低溫貯存條件確保了實驗菌株的長期穩(wěn)定性。實驗時混 勻后即可直接使用，節(jié)省了菌株鑒定、活化處理以及菌液濃度調(diào)整等時間。
3. 實驗陽性對照試劑種類覆蓋整個 Ames 實驗要求，在添加和不添加 S9 的情況下均可以誘導實驗菌株呈現(xiàn)陽性反應。陽性對照 試劑采購自國際大品牌公司，按照 Ames 實驗需求精準定量分 裝，出廠前經(jīng)過實驗檢測，陽性對照試劑的長期穩(wěn)定性有質(zhì)量 保證。
4. 底層培養(yǎng)基 VS、GS 以干粉形式提供，便于培養(yǎng)基長期穩(wěn)定 保存。使用前只需添加蒸餾水滅菌處理即可，試劑瓶采用耐高 溫材料，因此可以直接向試劑瓶中添加所需劑量的蒸餾水。
5. 頂層培養(yǎng)基 HB 凍干球采用先進無菌凍干干燥工藝制成，使用前需先用滅菌蒸餾水溶解，然后用 0.22μm 濾膜過濾除菌。
試劑盒應用范圍
本試劑盒應用范圍非常廣，可進行食品與飲用水、化學品、洗滌劑、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝 材料等遺傳毒理學檢測。
傳統(tǒng)實驗操作不足
周期長——培養(yǎng)基成分準備、誘導 S9 制備、菌株鑒定、菌株培養(yǎng) 等耗費大量時間。 穩(wěn)定性差——雜菌污染、活菌數(shù)不符合要求、實驗試劑配制不準 確等都會導致實驗失敗。
試劑盒優(yōu)勢
便捷—— 本試劑盒省去了培養(yǎng)基成分準備、誘導 S9 制備、菌株 鑒定、菌株培養(yǎng)等時間，可以直接使用，大大縮短了實驗周期。 準確——本試劑盒各成分均經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，無雜菌污染， 菌株特性與活菌數(shù)目以及誘導 S9 活性均符合 Ames 試驗要求，實 驗結(jié)果準確、可靠、重現(xiàn)性高。
穩(wěn)定—— 本試劑盒穩(wěn)定性強、易于運輸和保存。
試劑盒使用操作流程
1. 實驗器材、試劑準備：三角瓶、5mL 或 15mL 試管、100μl 和1000μl 槍頭、0.22μm 濾膜、注射器、平皿、二甲基亞砜、滅菌 蒸餾水等；
2. 設置待測物劑量，配制各劑量無菌待測物溶液；
3. VS、GS 培養(yǎng)基加水溶解并滅菌，配制底層培養(yǎng)基；
4. HB 球加滅菌蒸餾水溶解，充分混勻，然后過濾除菌；
5. 實驗當天配制頂層培養(yǎng)基，2ml 分裝，然后 45℃水浴保溫；
6. 用無菌蒸餾水溶解 S9 復合物并配制 S9 反應混合液；
7. 開展 Ames 實驗，將 2mL 頂層培養(yǎng)基+100μL 菌液+100μL 待測 物或陽性底物+500μL10% S9 混合液混勻，傾倒于底層培養(yǎng)基（實驗室溫度低時傾倒的頂層培養(yǎng)基易冷凝，可將底層培養(yǎng)基 放置于 37℃培養(yǎng)箱一段時間，然后再傾倒頂層培養(yǎng)基）；
8. 待頂層培養(yǎng)基冷凝后，將實驗平皿放入 37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng) 48h后觀察實驗結(jié)果；
試驗方法
試驗方法主要是平板摻入法和預培養(yǎng)平板摻入法，具體操作如下：
1. 平板摻入法
a) 準備所需底層培養(yǎng)基平皿若干。
b) 融化頂層培養(yǎng)基分裝于無菌小試管，每管2 mL，在45℃水 浴中保溫。
c) 在保溫的頂層培養(yǎng)基中依次加入測試菌株菌液0.1 mL，混 勻；加受試物0.05 mL~ 0.2 mL（一般加入0.1 mL。需活化時 另外再加入10 % S9反應混合液 0.5 mL），再混勻，然后迅 速傾入底層培養(yǎng)基上。轉(zhuǎn)動平皿，使頂層培養(yǎng)基均勻分布 在底層上，平放固化，37℃ 培養(yǎng) 48 h觀察結(jié)果。
d) 另做一陽性對照、溶劑對照和未處理對照。陽性對照不加 受試物，只加標準誘變劑（即試劑盒陽性對照試劑，見表2）；溶劑對照加除受試物和標準誘變劑以外的所有試劑， 如溶劑二甲基亞砜等（光譜純或分析純）；未處理對照只 在培養(yǎng)基上加菌液；其他方法同上。
2. 預培養(yǎng)平板摻入法 預培養(yǎng)對于某些受試物可取得較好效果。因此可根據(jù)情況確定 是否進行預培養(yǎng)。在加入頂層瓊脂前，先進行以下預培養(yǎng)步
驟：在試驗中，將受試物（需活化時另加入10% S9反應混合 液）和菌液，在37℃中培養(yǎng)20min，或在30℃中培養(yǎng)30min，然 后再加2mL頂層瓊脂，其他同上述平板摻入法。
試驗設計及受試物的特殊處理
1) 劑量設計 決定受試物最高劑量的原則是受試物對試驗菌株的毒性和受試物的溶解度。對于純的化學物質(zhì)，一般最低劑量為每平皿0.2 μg，最高劑量為 5 mg，或溶解度允許，或飽和濃度，或?qū)毦a(chǎn)生最小毒性濃度。對于毒性很低、攝入量很大的定型產(chǎn)品，可根據(jù)其溶解度和對細菌的毒性采用可能的最大劑量。每 種受試物在允許最高劑量下設4個（含4個）以上劑量，每劑量間隔不超過5倍，每個劑量應做三個平皿。
2) 溶劑 溶劑可選用水、二甲基亞砜或其他溶劑（溶劑劑量應限定在毒性劑量以下。以二甲基亞砜為例，平板摻入法每皿不超過0.1mL 溶劑；預培養(yǎng)平板摻入法每皿不超過0.01mL 溶劑）， 無論選用什么溶劑均應無誘變性。
3) 對照組的設置 試驗應同時設有陽性物對照組、溶劑對照組和未處理對照，均 包括加S9和不加S9兩種情況。
4) 受試物的特殊處理 若遇特殊受試物作非常規(guī)處理時應在報告中說明。對以下幾種情況可作如下處理：
a) 含組氨酸受試物：根據(jù)食品中測得的組氨酸含量若能誘發(fā) 回復突變率的增高可加設組氨酸平行對照組；或?qū)z品經(jīng)XAD-II樹脂柱過濾洗脫預處理。
b) 食品包裝材料及其制品成分：根據(jù)材料或制品的組成成 分，可分別采取過篩抽提、蒸發(fā)殘渣等技術(shù)處理。
c) 揮發(fā)性受試物：可采用真空干燥器處理等方法。
d) 天然植物材料：可按植物化學方法制備粗制品或純制品。
結(jié)果的判定
以直接計數(shù)培養(yǎng)基上長出回變菌落數(shù)的多少而定，如在背景生 長良好條件下，受試物組回變菌落數(shù)是溶劑對照回變菌落數(shù)的 兩倍或兩倍以上，并有劑量反應關(guān)系或至少某一測試點有可重 復的并有統(tǒng)計學意義的陽性反應，即可認為該受試物誘變試驗 陽性。受試物經(jīng)上述四個試驗菌株測定后，只要有一個試驗菌 株，無論在加S9或未加S9條件下為陽性，均可報告該受試物對 鼠傷寒沙門氏菌為致突變陽性。如果受試物經(jīng)四個試驗菌株檢 測后，無論加S9和未加S9均為陰性，則可報告該受試物為致突 變陰性。
Ames 實驗報道文獻舉例
廣東省疾病預防控制中心通過 Ames 試驗發(fā)現(xiàn)部分染發(fā)劑引起試驗 菌株 TA97、TA98、TA100 回變率明顯升高，提示部分染發(fā)類 產(chǎn)品具有致突變作用，可對健康產(chǎn)生危害。何冬梅等、中 國 衛(wèi) 生檢驗雜志 2007,17,(11)。
人參與女貞子是臨床上常見的有一定抗腫瘤效果的補益中藥，在 Ames 試驗中人參能抑制二氨基芴引起的 TA98 菌株回變菌落數(shù)的增加；女貞子能抑制疊氮鈉引起的 TA100 菌株回變菌落數(shù)的增加，分別表現(xiàn)出抗移碼型突變和抗堿基置換型突變的作用。倪婭等、中國保健 2009,17,(17)。生活飲用水經(jīng)投加二氧化氯處理后對水中石油類污染物具有較 強的去除作用，可使水中有毒有害有致癌性的物質(zhì)氧化降解為 毒性較小、無致癌作用的小分子物質(zhì)，并且致突變活性明顯降低，Ames 值由陽性轉(zhuǎn)為陰性。高慶然等、工業(yè)用水與廢水2001,6。
喹烯酮是我國自主研發(fā)的喹噁啉類一類新獸藥，作為抗菌促生 長劑用于豬飼料中， Ames 試驗表明喹烯酮對 TA97、TA98、 TA100 和 TA1537 加和不加 S9 在一定劑量下均為陽性。結(jié)果提 示，喹烯酮存在一定致突變毒性，應制定最高殘留限量。張偉 等、毒理學雜志 2007,04。
Ames 試驗表明煤和液化石油氣（LPG）燃燒顆粒物均具有很強 的直接和間接致突變作用，主要致突變作用來源于硝基和胺基多環(huán)芳烴，兩種顆粒物同時存在可加大致癌風險。閆洪濤等、 中國公共衛(wèi)生 2007,04。
烷基酚聚氧乙烯醚（APES） 是一大類表面活性劑家族，廣泛 用于家庭和工業(yè)的清潔產(chǎn)品，烷基酚類化合物是其降解產(chǎn)物， 其中對甲基苯酚、2,6-二甲基苯酚、4-乙基苯酚、4-辛基苯酚、對壬基苯酚、4-硝基苯酚、2-氯苯酚、1,3-二氯苯酚、2,4-二氯 苯酚、2,6-二氯苯酚、三氯苯酚和 2,3,5,6-四氯苯酚 12 種化合物 的 Ames 試驗表明除 2,4- 二氯苯酚未誘發(fā)各菌株的陽性反應外，其余 11 種待測物均誘發(fā)了陽性反應,說明這 11 種苯酚類化 合物均具有致突變性。楊麗等、東北師大學報（自然科學版）
2003,01。
重組葡糖激酶作為一種生物技術(shù)藥物具有明顯的溶栓和抗凝效果，Ames 實驗結(jié)果顯示重組葡糖激酶對試驗菌株 TA97 、TA98、TA100 和 TA102 無誘發(fā)回變作用。劉永學等、癌變·畸變·突變 2004,9。
常見問題及原因分析
1、自發(fā)回變數(shù)顯著低于標準 原因：a. 試劑盒保存條件不合適，菌株失活或營養(yǎng)成分降解；b.培養(yǎng)基配制操作過程中組氨酸、生物素添加量低；c.操作過程中添加菌液時頂層培養(yǎng)基溫度過高；
2、自發(fā)回變數(shù)顯著高于標準 原因：a. 培養(yǎng)基配制操作過程中組氨酸、生物素添加量高；b.培養(yǎng)皿經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒不徹底或環(huán)氧乙烷有殘留；
3、陽性底物誘變菌落數(shù)偏離標準范圍 原因：a. 陽性底物溶解不徹底或未充分混勻；b. 陽性底物添加量不準確；c. 試劑盒保存條件不合適或過期，陽性底物降解或 S9失活；d. 操作過程中添加菌液時頂層培養(yǎng)基溫度過高；
4、待測物誘變菌落數(shù)非常低或沒有菌落 原因：a. 待測物或待測物溶劑對細菌生長有毒性；b. 試劑盒保存條件不合適或過期，陽性底物降解或 S9 失活； c. 操作過程中添加菌液時頂層培養(yǎng)基溫度過高；
5、菌落分布不均勻，集中偏向一側(cè)。原因： 倒底層或頂層培養(yǎng)基時平皿未水平放置；
6、頂層或底層培養(yǎng)基凝固不充分或滑出平皿 原因：a. 頂層或底層培養(yǎng)基中瓊脂粉含量低；b. 頂層培養(yǎng)基中加入的溶劑或待測物酸化，導致凝膠不充分；
7、如何判斷 Ames 實驗結(jié)果是否為假陽性 將經(jīng)受試物和陽性對照物處理的 Ames 菌落進行增菌培養(yǎng)后接種于無組氨酸的培養(yǎng)基上,觀察比較細菌的生長情況。如果經(jīng)受試 物處理的菌株不能生長在無組氨酸的培養(yǎng)基中,而經(jīng)陽性對照物處 理的菌株則可以生長在無組氨酸的培養(yǎng)基上,則說明經(jīng)受試物處理 的菌株沒有發(fā)生突變，試驗中所觀察到的菌落數(shù)增加是假陽性。
標簽：
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