CAR-T療法在惡性血液腫瘤中展現(xiàn)出的強大實力，使其逐漸成為近年來最有前景的腫瘤免疫療法，然而血液腫瘤（非實體瘤）僅僅是眾多癌癥中較小的一部分，如2019年最新的全球癌癥數(shù)據(jù)指出：約90%的癌癥發(fā)病率都是由實體瘤引起，但關(guān)于實體瘤的細胞治療臨床試驗卻很少。

 

如下圖所示：2019年發(fā)表在Nature Reviews Drug Discovery的數(shù)據(jù)，自1993年開始的所有細胞治療試驗中，只有一半是針對實體瘤（1203項中有596項）（圖1）。

圖1. 實體瘤和血液腫瘤的細胞治療試驗比較

 

如表1，大部分細胞治療臨床研究都集中在少數(shù)癌種，如黑色素瘤（79項）、腦癌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌（75項）、肝癌（57項），而發(fā)病率較高的前列腺癌、乳腺癌、肺癌等都相對較少[1]。這些趨勢表明，與血液腫瘤相比，細胞治療實體瘤才是抗癌的主戰(zhàn)場，同時面對的挑戰(zhàn)也更大。

表1.  596例實體瘤試驗的總結(jié)

 

CAR-T療法在實體瘤中的挑戰(zhàn)

 

截至目前，全球已有兩款CAR-T產(chǎn)品獲批上市，且都是在血液腫瘤領(lǐng)域。而CAR-T在實體瘤上的臨床療效，遠不能令人滿意。究其原因，主要在于實體瘤的細胞療法存在不少難點，如不同類型實體瘤的異質(zhì)性大、缺乏獨特的腫瘤相關(guān)抗原作為CAR-T靶點、T細胞無法有效歸巢到腫瘤部位、CAR-T細胞持續(xù)性不夠以及腫瘤內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境對免疫有抑制作用。具體以下：

 

1.強大的免疫抑制微環(huán)境

腫瘤免疫微環(huán)境（tumor immune microenvironment，TIME）代表了實體瘤的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)，涉及免疫細胞，癌細胞，基質(zhì)細胞，細胞因子，趨化因子和細胞外基質(zhì)之間的相互作用。TIME形成高度免疫抑制的環(huán)境促進腫瘤增殖、存活和轉(zhuǎn)移。腫瘤相關(guān)巨噬細胞（Tumor-associated macrophages，TAM），癌癥相關(guān)的成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAF）和腫瘤細胞都可以分泌抑制性細胞因子和趨化因子。抑制性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，剛性細胞外基質(zhì)導(dǎo)致的遷移失敗，抗原呈遞不佳，長期T細胞受體（TCR）信號及腫瘤細胞和基質(zhì)細胞的抑制性受體表達都可能對免疫系統(tǒng)有效的抗腫瘤功能構(gòu)成強大的障礙。迄今為止，CAR-T細胞在實體瘤中的療效還受到限制，部分原因是免疫抑制性腫瘤微環(huán)境。實體瘤中復(fù)雜的TIME，有利于具有物理屏障、多種免疫抑制機制及多種生化因素的腫瘤進展，導(dǎo)致CAR-T細胞療法在癌癥患者臨床試驗中的療效有限。

 

2.高抗原異質(zhì)性

實體瘤中用于CAR-T細胞療法的抗原一般為腫瘤特異性抗原（tumor-specific antigen，TSA），如EGFRvIII、前列腺癌抗原PSA、黑色素瘤相關(guān)突變抗原1（MUM1）等，其在腫瘤細胞中高表達，正常細胞中不表達或低表達，然而這些抗原在同種腫瘤類型的不同患者中具有高度異質(zhì)性，使得CAR-T療法的療效受限。因為抗原的高度異質(zhì)性，每位患者都需要找到合適的TSAs，然后構(gòu)建特定的CAR-T細胞用于治療，這種方法非常復(fù)雜且費用高昂，大多數(shù)患者不能承受。

 

因此，盡管TSAs是構(gòu)建CAR-T細胞的理想靶點，但目前的CAR-T療法中很少有使用TSAs成功的案例。腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigen，TAA）在實體瘤CAR-T療法中也被廣泛探究，如Mesothelin、CEA及MUC1等，但靶向TAAs易對正常組織進行殺傷產(chǎn)生脫靶毒性。此外，還存在一類替代抗原也被廣泛研究，包括成纖維細胞活化蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）和血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）。此類抗原不表達在腫瘤細胞而是在腫瘤相關(guān)纖維母細胞和腫瘤血管中表達，對腫瘤細胞形成支撐位點，靶向這些抗原可通過阻礙基質(zhì)形成或血管生成破壞腫瘤形成。

 

3.密集的細胞外基質(zhì)

特定的腫瘤類型與獨特的腫瘤基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）相關(guān)。如多形性膠質(zhì)母細胞瘤和乳腺癌包含以巨噬細胞為主的基質(zhì)；在浸潤性乳腺癌中，與腫瘤相關(guān)的巨噬細胞可占腫瘤總量的50％以上，占與腫瘤相關(guān)的白細胞總數(shù)的80％。然而，成纖維細胞是結(jié)腸癌基質(zhì)中的主要成分。胰腺癌則與特別豐富的間質(zhì)有關(guān)，其特征在于致密的增生性浸潤。獨特的胰腺癌基質(zhì)對疾病的侵襲性很重要，并損害化學(xué)療法和放射療法的有效性。多項研究表明，獨特的基質(zhì)成分可能與疾病預(yù)后相關(guān)。

 

例如，TAM與人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤和乳腺癌的不良預(yù)后有關(guān)。此外，CAF與乳腺癌、口腔鱗狀細胞癌和食道癌的不良預(yù)后有關(guān)。如圖2所示，在ECM中，癌細胞和駐留成纖維細胞均可分化為CAF進而修飾ECM。ECM束縛及釋放的生長因子和趨化因子，以及腫瘤內(nèi)部細胞新陳代謝變化，都可形成促進腫瘤生長的腫瘤微環(huán)境。此外，CAF產(chǎn)生的細胞因子，如TGF-β和PDGF，可刺激血管細胞的血管新生[2]。

圖2.ECM在腫瘤進展和轉(zhuǎn)移中的潛在作用

 

在實體瘤中，胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）具有特別突出的基質(zhì)區(qū)室，部分特征在于突出的CAF群體和致密的膠原蛋白豐富的ECM。該ECM已被證明可以限制PDAC腫瘤微環(huán)境（TME）中的血管灌注，其可能原因是血清利用率低，PDAC環(huán)境營養(yǎng)不良。

 

CAR-T療法在實體瘤的進展

 

從以上描述可以得知，實體瘤的復(fù)雜性和多樣性，使得實體腫瘤的療效并不如人意。CAR-T細胞若想成功攻克腫瘤細胞，首先需要將CAR-T細胞轉(zhuǎn)運到腫瘤病變處。一旦它們在附近聚集，必須有效地滲入腫瘤，在遷移到實體瘤病灶后，CAR-T細胞必須克服敵對的免疫抑制因子才能引起特異性細胞毒性[3]，如圖3所示。

圖3. 實體瘤免疫抑制微環(huán)境

 

因此，針對上述難題，科學(xué)家們通過向T細胞中引入新的共刺激域，細胞因子基因以及細胞因子受體等策略來增強CAR-T細胞的持久性和抗腫瘤活性。

 

1.促進T細胞運輸至腫瘤部位

促進運輸主要有2種策略：

• 使用趨化因子受體修飾CAR-T細胞；修飾的T細胞可特異性結(jié)合腫瘤產(chǎn)生的趨化因子，從而改善CAR-T細胞向腫瘤部位的歸巢。已經(jīng)證明，增加間皮素CAR-T細胞和GD2 CAR-T細胞中CCR2b表達，由于CAR-T細胞向腫瘤病變的遷移增加，而導(dǎo)致惡性胸膜間皮瘤和神經(jīng)母細胞瘤的抗腫瘤作用得到改善。除了CCR2表達外，CCR4共表達可改善CD30 CAR-T細胞向分泌CCL17（CCR4的配體）的CD30+ HL的歸巢，從而改善抗淋巴瘤的作用。

• 將CAR-T細胞局部給藥于腫瘤部位；靜脈輸注目前被認(rèn)為是過繼細胞療法的標(biāo)準(zhǔn)方法。因此，CAR-T細胞必須遷移至實體瘤區(qū)域發(fā)揮作用。改善T細胞遷移的策略是將CAR-T細胞局部作用于腫瘤部位，如局部給藥于腫瘤內(nèi)（NCT02587689）、顱內(nèi)（NCT00730613）、胸膜（NCT02414269）和肝動脈（NCT01373047）(clinicaltrials.gov)等的多項臨床試驗正在進行中。

2.改善免疫抑制微環(huán)境

在實體瘤中，即使CAR-T細胞能夠遷移到腫瘤部位，CAR-T細胞也面臨著敵對的腫瘤微環(huán)境（TME）。實體瘤通常會被大量的免疫抑制細胞浸潤，包括M2腫瘤相關(guān)巨噬細胞，髓樣抑制細胞（MDSC）以及調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）和B細胞，它們可保護惡性細胞免受免疫細胞的抗腫瘤活性。此外，免疫抑制細胞因子和抑制性免疫檢查點在腫瘤的發(fā)病機理和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用，并限制了癌癥免疫療法的治療潛力。因此，建立有利的TME以開發(fā)在癌癥免疫治療中的療效，抑制腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制機制至關(guān)重要。主要包括以下方面：

 

1）使用針對免疫檢查點的免疫調(diào)節(jié)劑來增強TME中的內(nèi)源性抗腫瘤免疫力

T細胞表達共抑制受體，以降低CAR-T細胞的抗腫瘤活性。近年來，PD-1作為促進CAR-T細胞效力的潛在靶標(biāo)被大量研究。操縱PD-1在CAR-T細胞上表達的策略包括同時使用PD-1/PD-L1阻斷抗體，去除T細胞中PD-1表達及分泌自分泌分子誘導(dǎo)CAR-T細胞阻滯PD-1/PD -L1。Noman等人證明了阻斷PD-L1可防止MDSC抑制T細胞。阻斷TME中PD-L1+ MDSCs和Treg可增強CEA CAR-T細胞的抗腫瘤能力。表達PD-1抗體的CAR-T細胞用于實體瘤治療的多項臨床試驗正在進行中（NCT03030001，NCT02873390，NCT03179007，NCT03182816，NCT03182803，NCT03615313）。

 

2）靶向TME中的調(diào)節(jié)細胞

例如Treg，TAM和MDSC。在異種移植肉瘤模型中，GD2 CAR-T細胞與MDSC消耗聯(lián)合給藥可產(chǎn)生顯著的抗腫瘤功效，而單獨的CAR-T細胞僅引起最小的抗腫瘤活性。

 

3）修改TME的細胞因子和趨化因子

如已開發(fā)出可以將IL-4的負信號（TME中經(jīng)常存在的細胞因子）轉(zhuǎn)換為IL-7的正信號的嵌合開關(guān)受體，用于設(shè)計前列腺干細胞抗原（PSCA）特異性的CAR-T細胞。具有可誘導(dǎo)的IL-18的CAR-T細胞使免疫細胞內(nèi)的平衡朝著Th1急性期反應(yīng)傾斜，從而減少免疫抑制細胞（如Tregs和CD206+巨噬細胞）的數(shù)量，從而導(dǎo)致對腫瘤的免疫增強。前列腺特異性膜抗原CAR-T細胞共表達顯性陰性的TGF-β受體，在侵襲性前列腺癌中可觀察到增殖增加，細胞因子分泌增強，耗竭減弱，體內(nèi)長期持久性及通過CAR-T細胞根除惡性腫瘤。

 

目前一項共表達TGF-βRⅡ的CAR-T細胞的臨床試驗正在進行中，以評估對復(fù)發(fā)和難治性轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的治療作用（NCT03089203）。此外，具有增強的細胞因子分泌功能的工程CAR-T細胞，稱為TRUCKs。在臨床前試驗中，靶向MUC16可分泌IL-12的CAR-T細胞已根除卵巢癌。具有自分泌IL-12表達的工程CAR-T細胞通過促進CD8+ T細胞功能并繞開抑制性TME而改善抗腫瘤活性。目前正在進行MUC16 TRUCKs對實體瘤治療的臨床試驗（NCT02498912）。溶瘤病毒局部遞送趨化因子RANTES和細胞因子IL-15顯著增加了抗GD2 CAR-T細胞的持久性，并提高了成神經(jīng)母細胞瘤細胞小鼠的存活率。

 

VEGFR-1特異性CAR-T細胞可延遲腫瘤的生長和形成并抑制異種移植腫瘤模型中肺轉(zhuǎn)移。大量研究表明，γ鏈（γc）家族細胞因子可用于增強CAR-T細胞的免疫力，IL-2、IL-4、IL-7、IL-15和IL-21可以減輕TME中免疫抑制因子的作用，并顯著提高CAR-T療效。

 

3.根據(jù)TME選擇合適抗原

TME不僅對腫瘤的生長至關(guān)重要，而且在腫瘤中產(chǎn)生了強大的免疫抑制位，因此腫瘤細胞可以逃脫宿主的免疫監(jiān)視。隨著針對實體瘤的CAR-T治療的臨床試驗數(shù)量不斷增加，現(xiàn)對這些試驗進行總結(jié)，以探索基于特定TME選擇合適靶點的方法。如下圖為針對不同的癌癥的抗原分類及相應(yīng)的臨床試驗數(shù)目。

圖4. 不同癌癥的CAR-T靶點分類

 

圖5. 針對實體瘤的CAR-T臨床試驗

 

CAR-T治療最常用的靶標(biāo)是表面抗原，例如用于結(jié)直腸腺癌的癌胚抗原（CEA），用于惡性胸膜間皮瘤的成纖維細胞活化蛋白，用于神經(jīng)母細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、黑素瘤和骨肉瘤的雙神經(jīng)節(jié)苷脂GD2，人類表皮生長因子受體 2（HER2）用于HER2陽性肉瘤，間皮素用于胰腺癌，IL-13受體α（IL-13Rα）用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤，突變體αvβ6整聯(lián)蛋白用于胰腺腫瘤[4]。下面舉幾個例子：

 

1）GBM-CAR-T的理想靶點：EGFRvⅢ

針對膠質(zhì)母細胞瘤（GBM,Glioblastoma）相關(guān)抗原的CAR-T治療包括EGFRvⅢ，IL-13Rα2，HER2和EphA2，其中EGFRvⅢ特異的CAR-T治療在臨床前模型中取得了最大的進展，從而加快了將該新療法轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的速度。EGFRvⅢ在CD133+膠質(zhì)母細胞瘤癌癥干細胞中很常見，且具有高度的自我更新和腫瘤啟動能力。據(jù)報道，賓夕法尼亞大學(xué)的一項臨床試驗用抗EGFRvⅢ CAR-T細胞治療10例EGFRvⅢ陽性GBM患者是安全的，并且沒有脫靶效應(yīng)，CRS及與野生型EGFR交叉反應(yīng)，但在復(fù)發(fā)切除的腫瘤組織中EGFRvⅢ表達會隨著時間的流逝而丟失。GBM中抗原丟失和腫瘤內(nèi)以及個體間異質(zhì)性的特征增加了CAR-T細胞治療的難度，在這種情況下，找到其他靶標(biāo)以減少免疫逃逸的機會并增強抗腫瘤免疫反應(yīng)尤其重要。目前臨床研究正在進行針對GBM中靶向IL-13Rα2和HER-2的CAR-T細胞總體安全性和療效的評價。

 

2）適用于多種實體瘤的CAR-T靶點：Mesothelin

間皮素（Mesothelin）是一種TAAs，在各種實體瘤中高表達如上皮樣間皮瘤、肝外膽道癌、胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）、卵巢癌和胃癌�，F(xiàn)有報道數(shù)據(jù)表明，其表達增加與卵巢癌、膽管癌、胰腺癌、三陰性乳腺癌和肺腺癌患者預(yù)后較差有關(guān)。鑒于Mesothelin特異性CAR-T細胞具有抗腫瘤作用，在上皮性卵巢癌，惡性上皮性胸膜間皮瘤和PDAC患者中進行的臨床試驗產(chǎn)生了直接的抗腫瘤功效（NCT02159716）。正在進行的各種Mesothelin特異性CAR-T試驗結(jié)果表明，Mesothelin是表達Mesothelin的實體瘤中CAR-T療法的有效靶標(biāo)（NCT02414269和NCT02465983）。

 

3）表面糖脂抗原CAR靶點：神經(jīng)節(jié)苷脂GD2

GD2在多種腫瘤細胞中高度過表達，包括神經(jīng)母細胞瘤、星形細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、尤因氏肉瘤、橫紋肌肉瘤、小細胞肺癌、黑色素瘤和乳腺癌，但在包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)（主要在神經(jīng)元細胞和間充質(zhì)干細胞）在內(nèi)的正常組織中表達受限，在周圍神經(jīng)和皮膚黑素細胞中低表達。迄今為止，抗GD2-CARs已在神經(jīng)母細胞瘤，骨肉瘤和黑色素瘤等多種疾病的臨床前和臨床試驗中進行了深入研究。Pule等產(chǎn)生EBV特異性T細胞以識別GD2，并將這些GD2 CAR-T細胞注入患者體內(nèi)以治療神經(jīng)母細胞瘤，發(fā)現(xiàn)病毒特異性GD2 CAR-T細胞持續(xù)存在并表現(xiàn)出中等的抗神經(jīng)母細胞瘤活性。在抗GD2 CAR-T細胞在黑色素瘤中的細胞毒性研究中發(fā)現(xiàn)GD2陽性黑色素瘤細胞在體外的特異性裂解。在PDX模型中，靜脈或瘤內(nèi)注射抗GD2 CAR-T細胞的小鼠其腫瘤得到快速的消退。目前以GD2為靶點的CARs在多種實體瘤中進行多項臨床試驗（NCT02992210，NCT02761915，NCT03373097和NCT02765243）。

 

4.靶向胞外基質(zhì)

大多數(shù)CAR-T細胞靶向癌細胞上的抗原，但在非惡性腫瘤相關(guān)基質(zhì)細胞表面表達的一些抗原靶標(biāo)也適合CAR-T細胞如FAP，F(xiàn)AP是一種跨膜絲氨酸蛋白酶，90％以上的上皮癌非惡性腫瘤相關(guān)基質(zhì)細胞中高表達，而在健康的成人組織中卻低表達。選擇此類靶點存在以下優(yōu)點：

• 基質(zhì)細胞比癌細胞具有更高的遺傳穩(wěn)定性，更容易以穩(wěn)定的方式用抗原靶標(biāo)靶向基質(zhì)細胞。

• 腫瘤基質(zhì)可支持腫瘤細胞生長，侵襲和血管生成，從而形成針對靶向腫瘤免疫療法的物理屏障，并通過吸引免疫抑制細胞，調(diào)節(jié)T細胞功能和表達抑制分子來建立免疫抑制位。而靶向基質(zhì)細胞可破壞這些功能，同時延緩腫瘤生長。

• 腫瘤基質(zhì)支持腫瘤生長的機制很普遍，針對此類機制的靶向療法可能具有廣泛的腫瘤應(yīng)用潛力。

迄今為止，已有數(shù)個使用抗FAP CAR-T細胞的研究成果。蘇黎世大學(xué)贊助的針對FAP的CAR-T治療已進入I期臨床試驗，用于惡性胸膜間皮瘤患者（NCT01722149）。

 

目前，大約有三分之一的CAR-T臨床試驗正在評估CAR-T治療實體瘤的方法，現(xiàn)在有多家公司正在進入該領(lǐng)域。近年來，通過開發(fā)新方法以克服實體瘤引起的障礙并針對這些特定適應(yīng)癥優(yōu)化CAR-T治療，如增加T細胞對腫瘤可及性和CAR-T在腫瘤部位的浸潤，中和或調(diào)節(jié)免疫抑制性TME，改善CAR-T功能，減輕潛在的毒性。除了以上策略之外，使用基因編輯技術(shù)如CRISPR-Cas9構(gòu)建通用型CAR-T細胞，以使其臨床應(yīng)用廣泛普及也是目前的重要發(fā)展方向。

 

參考文獻

[1]. Jia Xin Yu, Vanessa M. Hubbard-Lucey and Jun Tang. The global pipeline of cell therapies for cancer. Nature Reviews Drug Discovery.

[2]. Eble JA, Niland S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clin Exp Metastasis. 2019 Jun;36(3):171-198.

[3]. Dan Li, Xue Li, Wei-Lin Zhou, et al. Genetically engineered T cells for cancer immunotherapy. Signal Transduction and Targeted Therapy. 35 (2019): 1–17.

[4]. Springuel L, Lonez C, Alexandre B, et al. Chimeric Antigen Receptor-T Cells for Targeting Solid Tumors: Current Challenges and Existing Strategies. BioDrugs. 2019 Jul 30.