小鼠腹腔巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)方法
瀏覽次數(shù):236 發(fā)布日期:2019-11-5
來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
小鼠腹腔巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)方法!
小鼠腹腔巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)可以:
(1)用于細(xì)胞保種;
(2)用于分子生物學(xué)研究;
(3)用于基因治療研究。
巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞,有多種功能,是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象。巨噬細(xì)胞容易獲得,便于培養(yǎng),并可進(jìn)行純化。巨噬細(xì)胞屬不繁殖細(xì)胞群,在條件適宜下可生活2-3周,多用做原代培養(yǎng),難以長期生存。巨噬細(xì)胞也建有無限細(xì)胞系,大多來自小鼠,如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等,均獲惡性,培養(yǎng)中呈巨噬細(xì)胞形態(tài)和吞噬功能,易于傳代和瓶壁分離,但難以建株。
實驗材料:小鼠 試劑、試劑盒 .RPMI1640培養(yǎng)基、酚紅、酒精、小牛血清、巰基乙醇酸鈉、雙抗、培養(yǎng)液、青霉素、鏈霉素、臺盼蘭、碘酒。
儀器、耗材:綿球、手術(shù)直剪、注射器、培養(yǎng)皿、超凈臺、解剖板、眼科剪、離心管、眼科鑷。
一、材料準(zhǔn)備
1.動物:各個品系的小鼠2-4只。
2.試劑:RPMI1640培養(yǎng)基(含酚紅),小牛血清,雙抗,培養(yǎng)液(10%小牛血清、RPMI1640、雙抗),臺盼蘭等。碘酒綿球和酒精綿球。
3.器械:一次性注射器、手術(shù)器械。
二、操作過程
如果采用刺激物,則可在實驗前三天腹腔注射3%巰基乙醇酸鈉每只2 mL,獲得的巨噬細(xì)胞數(shù)要多一些。不采用刺激物,直接開始下面的步驟。
1.拉頸處死小鼠,在75%酒精浸泡1-2分鐘,移入超凈臺中,仰臥位固定于解剖板上,碘酒消毒腹部皮膚,酒精綿球脫碘。用手術(shù)直剪充分剪開腹部皮膚,暴露腹部肌層,再用酒精綿球消毒腹部肌層。
2.用注射器抽取5 mL含雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基注入腹腔,用綿球輕揉腹部1-2 min,然后,用眼科鑷稍提起腹腔,并用眼科剪剪開一個小口,用吸管吸取細(xì)胞懸液,移入離心管中(個人認(rèn)為,此法比用注射器抽吸好一些)。
3.1 000 rpm離心5 min后,用含雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌一次,再次離心,重懸細(xì)胞于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中,如果是作為飼養(yǎng)細(xì)胞使用,則選擇相應(yīng)的培養(yǎng)液。臺盼藍(lán)拒染法計數(shù),將細(xì)胞稀釋到目的濃度后,接種即可。
4.如果是作為飼養(yǎng)細(xì)胞使用,調(diào)整濃度至2x105個/mL,接種到96孔板中,每孔100-200 μL;如果作為其它實驗使用,可以調(diào)整成2x106/mL,加到24孔平底培養(yǎng)板中,1 mL/孔;5% CO2溫箱孵育2 h后,換液,并用RPMI1640培養(yǎng)基洗1-2次,棄去未粘附細(xì)胞,貼壁細(xì)胞為單層的巨噬細(xì)胞。
三、結(jié)果分析
巨噬細(xì)胞剛貼壁時偏圓形,或者類似鵝卵石形狀,然后慢慢伸出偽足,鋪開呈三角形或多角形。巨噬細(xì)胞有吞噬的特性,當(dāng)與細(xì)菌混合在一起的時候,在40倍物鏡下可以看到巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌,因此,巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞可以清除部分污染的細(xì)菌、支原體和部分細(xì)胞碎片。
四、注意事項
1.巨噬細(xì)胞是終末分化細(xì)胞,不會增殖。
2.很難消化下來,所以接種的時候,必須直接接種到目的培養(yǎng)器皿中。
3.嚴(yán)格無菌操作,在超凈臺內(nèi)進(jìn)行。
4.為避免交叉感染,每一只小鼠更換注射器。
5.吸管吸取細(xì)胞懸液的時候,盡量不要吸到大小腸,否則容易引起成纖維細(xì)胞污染。