本實驗樣品來自于人、狗、貓、老鼠、牛、馬，還有魚和蛤等新鮮動物組織樣品，使用高通量組織研磨法處理，經(jīng)Real-Time Taqman PCR方法，提取并檢測RNA/cDNA和基因組DNA的提取質量，最終得出結論：使用SPEX高通量組織研磨儀研磨動物組織，可以快速高通量的完成樣品制備，且核酸提取量高、提取的核酸質量好。
 
 
1、樣品采集、制備和組織研磨
    采集新鮮動物組織樣本，修剪至約50-100mg濕重，在液氮中快速冷凍，并保存在-80℃低溫冰箱中。樣品來自于人、狗、貓、老鼠、牛、馬，還有魚和蛤（見表1所示）。在提取DNA或RNA之前，將這些冷凍后的組織，放入深孔板中，并將深孔板放置在干冰上冷凍。每個孔中放入兩顆4m鋼珠(SPEX貨號2150) ，再加入500mL緩沖液(應用生物系統(tǒng)核酸純化裂解緩沖液)。用深孔板蓋板密封，在高通量組織研磨儀上以每分鐘1000次的速度研磨2min。4℃環(huán)境下培養(yǎng)30min后，用裂解液提取gDNA或總RNA。使用高通量組織研磨儀優(yōu)化后，再使用6700全自動核酸工作站進行實時PCR，最后提取的RNA或DNA的組織量在10到20mg之間。
 
2、采用Real-Time Taqman PCR技術對提取的RNA/cDNA和基因組DNA進行質量控制
    為評價提取的RNA的質量，采用Invitrogen產(chǎn)品合成互補DNA (cDNA)：200 units of SuperScript III, 600 ng of random hexadeoxyribonucleotide (pd(N)6) primer (random hexameter priner), 10 U RnaseOut (Rnase inhibitor), and 1 mM dNTPs in a final volume of 40 L.
    逆轉錄反應在50℃下進行50min，加入60微升水，加熱5min至95℃，在冰上冷卻，終止反應。根據(jù)內源性對照TaqMan PCR系統(tǒng)從一定數(shù)量的組織中獲得的CT值判斷cDNA的質量。值高于一定閾值的樣品表明樣品質量受損，總RNA降解，需要重新提取備用樣品。為了評估cDNA的質量，我們通常使用的TaqMan PCR系統(tǒng)，目標是物種特異性的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)或核糖體基因(如18S rRNA或ITS-2)。
    為了評估提取的基因組DNA的質量，開發(fā)了針對單個拷貝基因的物種特異性TaqMan PCR系統(tǒng)，以定量基因組當量和細胞數(shù)量。表1概述了用于gDNA質量控制的TaqMan系統(tǒng)。使用針對單個復制基因的TaqMan PCR系統(tǒng)，根據(jù)CT值判斷一定數(shù)量組織的gDNA質量。值高于某一閾值的樣本表明DNA已經(jīng)降解，需要重新提取備用樣本。GAPDH TaqMan系統(tǒng)可以用來靶向單拷貝GAPDH偽基因。
    每個Real-Time TaqMan每個引物的PCR反應包含400nM，80nM的TaqMan探針和市場上買到的PCR試劑(TaqMan一般性PCR試劑：Applied Biosystems)包含10mM Tris-HCl (pH值8.3)，50 mM KCl，MgCl₂ 2.5mM，2.5mM三磷酸脫氧核苷酸，0.625 U AmpliTaq Gold DNA polymerase per reaction, 0.25 U AmpErase UNG per reaction and 5μL of the diluted cDNA sample or the gDNA in a final volume of 25 μL.樣品置于96孔板中，在自動熒光儀(ABI PRISM 7700序列檢測系統(tǒng)，Applied Biosystems)中擴增。擴增條件為50℃時為2 min, 95℃時為10 min, 95℃時為40個15s，60℃時為60 s循環(huán)。
 

1. 結論

    使用SPEX高通量組織研磨儀研磨動物組織，可以快速高通量的完成樣品制備，且核酸提取量高、提取的核酸質量好。