眾所周知，CRISPR/Cas9被業(yè)內(nèi)譽為“基因剪刀”，它可以高效地實現(xiàn)靶基因的編輯，自問世以來就備受關(guān)注和青睞。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是由CRISPR相關(guān)基因和Cas9組成，Cas9核酸酶會在向?qū)�RNA（Guide RNA, gRNA）的指引下，在完整基因組上的特定位點完成切割反應(yīng)，同時Cas9的切割也依賴于gRNA和基因組特定位點配對區(qū)5′端的PAM結(jié)構(gòu)。

在前幾期中我們已經(jīng)詳細(xì)介紹過利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建基因編輯大小鼠的基本流程。然而，在具體的實驗過程中，首先大部分的我們都會遇到這樣一個問題，該如何根據(jù)研究目的設(shè)計sgRNA，如何選擇活性較高的sgRNA等。

在2013年，哈佛大學(xué)David Liu課題組通過研究證明CRISPR/Cas9的特異性僅與gRNA配對的靠近PAM處7-12bp堿基相關(guān),這說明CRISPR/Cas9系統(tǒng)仍存在一定的脫靶風(fēng)險。因此如何降低CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)也成為科研工作者始終關(guān)注的焦點問題。由此，設(shè)計并篩選高效特異性的gRNA對于降低該系統(tǒng)的脫靶顯得至關(guān)重要。

今天，小編綜合科學(xué)家們已發(fā)表的研究結(jié)果及自己的實驗經(jīng)驗，為大家詳細(xì)介紹一下如何設(shè)計和篩選高效的sgRNA。

根據(jù)實驗?zāi)康牟檎夷康幕�因序列，并確定需要編輯的具體區(qū)域。將該區(qū)域的堿基序列復(fù)制至sgRNA預(yù)測網(wǎng)站gRNA Designer，從而預(yù)測潛在sgRNA序列。接下來根據(jù)預(yù)測得分值來選擇sgRNA靶點(圖1)。

gRNA designer網(wǎng)址：http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design-v1

 圖1. 利用gRNA Designer軟件進(jìn)行靶點預(yù)測

選擇了得分值較高的一個或數(shù)個sgRNA位點后，則需要進(jìn)一步優(yōu)化。首先比對初選的候選靶點的核心序列（靠近PAM處7-12bp堿基）在基因組中是否特異，如果在基因組上存在與候選靶點相似度高的序列，則應(yīng)放棄該候選靶點。

由于體內(nèi)的基因組具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，僅憑軟件預(yù)測和理論推導(dǎo)仍無法確定所選擇的gRNA是否有效，以及活性是否較高，因此我們需要進(jìn)行g(shù)RNA活性篩選。

首先我們將所選gRNA對應(yīng)的基因組靶點上下游各400bp（共800bp）的片段克隆至pUCA(Luc)質(zhì)粒中，以造成熒光素酶（luciferase）蛋白翻譯提前終止，從而表達(dá)無功能的熒光素酶。

同時將gRNA構(gòu)建至px459質(zhì)粒中，與pUCA共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，Cas9蛋白能對靶位點的切割形成完整的熒光素酶編碼序列，從而表達(dá)有功能的熒光素酶。因為熒光素酶的活性與CRISPR/Cas9 的活性成正相關(guān)，所以可利用Luciferase report試劑盒，通過檢測熒光素酶表達(dá)量來指示gRNA的活性（圖2）。

圖2. gRNA活性檢測流程圖

篩選出了活性高的gRNA后，似乎下一步加上Cas9蛋白酶就構(gòu)成了CRISPR/Cas9系統(tǒng)了，可以用來構(gòu)建基因編輯動物了。但其實還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，其中還有很多十分重要的環(huán)節(jié)，你也必須掌握，且聽下次分解。

參考文獻(xiàn)：

Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013;339(6121):819-23.

Pattanayak V, Lin S, Guilinger JP et al.High-throughputprofiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nat Biotechnol. 2013;31(9):839-43.