你聽說過喀邁拉獸（chimera）嗎？沒錯(cuò)，就是古希臘神話故事中一只會(huì)噴火的怪獸，這種怪獸擁有獅頭、羊身、蛇尾，像是由幾種動(dòng)物拼成的。

或許你知道喀邁拉獸，但你是否知道在生物遺傳學(xué)中也有一種名為喀邁拉的動(dòng)物嗎？那這神奇的怪獸與我們生物領(lǐng)域中的ES細(xì)胞基因打靶到底有什么關(guān)系呢？本期話題，咱們就一起來聊聊遺傳學(xué)中的chimera。

圖1. 希臘神話中的喀邁拉獸（左）和現(xiàn)代生物遺傳學(xué)中的 “Chimera”（右）

Chimera在生物學(xué)中是一種很常見的現(xiàn)象，一般可以理解為嵌合體，如怪獸是由不同動(dòng)物組成，在生物中如上圖的老鼠，就是ES細(xì)胞打靶技術(shù)得到的chimera小鼠。

之所以這里談?wù)揈S細(xì)胞，是因?yàn)檫@項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因功能和基礎(chǔ)理論的研究、疾病模型的建立、基因治療和優(yōu)質(zhì)育種等。小編現(xiàn)在就帶著大家一步步走入ES細(xì)胞這個(gè)神奇的世界，把此技術(shù)的原理及實(shí)驗(yàn)技巧等心得毫無保留地分享給大家。

ES細(xì)胞打靶的原理

胚胎干細(xì)胞( Embryonic Stem Cell, ESC )是在胚胎植入子宮前，從囊胚狀態(tài)的胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（Inner cell mass, ICM）分離出來的一群多能干細(xì)胞，理論上可分化為任意的體細(xì)胞。

基因打靶技術(shù)即建立在ES細(xì)胞與DNA同源重組等技術(shù)基礎(chǔ)上的分子生物學(xué)技術(shù)。利用同源重組技術(shù)對(duì)ES細(xì)胞特定位點(diǎn)的基因進(jìn)行改造，通過顯微注射或者胚胎融合的方法將經(jīng)過遺傳修飾的ES細(xì)胞引入受體胚胎內(nèi)。遺傳修飾的ES細(xì)胞仍然保持分化的全能性，可以發(fā)育為嵌合體動(dòng)物的生殖細(xì)胞，使得修飾的遺傳信息經(jīng)生殖系遺傳。尤其是近幾年CRISPR/Cas9掀起的基因編輯浪潮，極大地催化了ES細(xì)胞基因打靶技術(shù)的步伐，豐富了科研人員對(duì)人類疾病和相關(guān)基因功能的了解。（圖2）

圖2.CRISPR-Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯

ES細(xì)胞打靶的實(shí)驗(yàn)步驟：

1. ES細(xì)胞擴(kuò)增至合適密度，消化并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。為提高電轉(zhuǎn)效率，用1xDPBS重懸細(xì)胞沉淀；

2. 細(xì)胞計(jì)數(shù)后取5x106細(xì)胞懸液至滅菌1.5ml EP管中，并加入sgRNA（10μg）和Cas9（10μg）表達(dá)質(zhì)粒、Donor質(zhì)粒（15μg），混合均勻，并將體積用1XDPBS補(bǔ)至800μl，后將液體轉(zhuǎn)移至潔凈電轉(zhuǎn)杯（Bio-Rad, 4mm）中；

3. 電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)后向電轉(zhuǎn)杯中加500μl預(yù)熱ES medium，用槍輕輕吹勻并小心吸出液體，加入預(yù)先準(zhǔn)備ES medium的10cm皿中，搖勻培養(yǎng)；

4. 24h后吸出舊的培養(yǎng)基，1XDPBS清洗細(xì)胞碎片，后加入8ml新鮮ES培養(yǎng)急基；

5. 48h后加puromycin（濃度為1.2—3.0μg/ml）進(jìn)行篩選；

6. 每天換液，約篩選6天開始挑取單克隆至48孔板中；

7. 待7—9天克隆長起來后將其分別傳代至24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)；

8. 約2—3天克隆成功擴(kuò)增后每個(gè)孔取3/4細(xì)胞進(jìn)行基因型鑒定，1/4細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)；

9. 基因型鑒定完成后，即可根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)安排胚胎囊胚注射實(shí)驗(yàn)，并將注射后的胚胎移植到假孕母鼠體內(nèi)；

10. 待小鼠出生后鑒定子代嵌合體（chimera）形成情況，并通過子代嵌合體小鼠的交配繁殖獲得能穩(wěn)定遺傳的小鼠。

圖3. 利用ES細(xì)胞打靶獲得基因編輯小鼠過程

注意細(xì)節(jié)：

1. ES細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)階段確保細(xì)胞質(zhì)量，若細(xì)胞狀態(tài)不佳可將細(xì)胞傳一代后再培養(yǎng)；

2. ES細(xì)胞培養(yǎng)及電轉(zhuǎn)過程中應(yīng)確保環(huán)境潔凈無污染，否則將導(dǎo)致細(xì)胞污染死亡；

3. 電轉(zhuǎn)時(shí)細(xì)胞數(shù)量不少于4x106，細(xì)胞數(shù)量太少導(dǎo)致電轉(zhuǎn)后存活的細(xì)胞極少，影響陽性克隆篩選；

4. 挑取單克隆前為保證環(huán)境條件良好，UV（紫外線）照射時(shí)間不少于2小時(shí)；

5. ES細(xì)胞囊胚注射對(duì)細(xì)胞質(zhì)量要求較高，因此盡量選用代數(shù)靠前且狀態(tài)較好的細(xì)胞株進(jìn)行囊胚注射。

總之，胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)需要更嚴(yán)格的環(huán)境，培養(yǎng)過程中一定要保證細(xì)胞不分化、不污染。在進(jìn)行電轉(zhuǎn)試驗(yàn)后應(yīng)每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，使ES細(xì)胞始終保持良好的生長狀態(tài)。（關(guān)于ES細(xì)胞顯微注射和基因型鑒定等技巧，我們會(huì)后續(xù)介紹，期待您繼續(xù)關(guān)注我們動(dòng)態(tài)。）

近10年來生命科學(xué)領(lǐng)域都有利用ES細(xì)胞基因打靶技術(shù)新建立各種疾病模型，為疾病機(jī)理研究、新藥研發(fā)和治療方案評(píng)價(jià)提供了寶貴的資源。早已經(jīng)是一項(xiàng)生物分子學(xué)領(lǐng)域筒子們必備的技能。

或許希臘神話中的喀邁拉獸（chimera）不大可能會(huì)中成為實(shí)現(xiàn)，但利用ES細(xì)胞基因打靶產(chǎn)生的嵌合體（chimera）會(huì)為人類認(rèn)識(shí)自我本質(zhì)，攻克重大疾病提供不可或缺的資源。就讓我們拭目以待吧！

這項(xiàng)技能您get到了嗎？如果您有更好的建議或者想了解更多的實(shí)驗(yàn)技巧，可以關(guān)注我們公眾號(hào)，給我們留言哦！我們期待您的參與！