肥胖和2型糖尿病的全球發(fā)病率在過去的30年中顯著增加，已嚴(yán)重危害人們的生命健康。脂肪組織被認(rèn)為與該類疾病相關(guān)，因此操縱脂肪細(xì)胞的分化和成熟有望用于臨床治療。大量研究已闡明轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳（DNA和組蛋白修飾）在脂肪發(fā)生過程中的重要作用，但是對(duì)于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控如何影響脂肪生成，尚不清楚。

近日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究人員在這一領(lǐng)域取得了新進(jìn)展。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院的博士研究生宋彤星和楊陽為并列第一作者，彭健和蔣思文教授為共同通訊作者。他們?cè)凇禢ucleic Acids Research》上發(fā)表了題為“Zfp217 mediates m6A mRNA methylation to orchestrate transcriptional and posttranscriptional regulation to promote adipogenic differentiation”的文章，首次發(fā)現(xiàn)了ZFP217直接激活m6A去甲基化酶FTO的表達(dá)，并結(jié)合m6A閱讀蛋白YTHDF2，促進(jìn)FTO對(duì)m6A mRNA的結(jié)合，從而促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化。

鋅指蛋白217（Zfp217）是眾所周知的致癌蛋白，在多種癌癥中上調(diào)，對(duì)胚胎干細(xì)胞的分化至關(guān)重要。值得注意的是，Zfp217將基因轉(zhuǎn)錄與新生RNA上的m6A修飾緊密關(guān)聯(lián)，表明Zfp217在協(xié)調(diào)表觀遺傳和表觀轉(zhuǎn)錄組網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用。于是，研究人員猜測Zfp217可能通過調(diào)節(jié)m6A修飾而加速脂肪生成。

Zfp217抑制導(dǎo)致m6A修飾的增加

為了探索Zfp217在成脂分化中的作用，研究人員首先利用siRNA開展了功能缺失實(shí)驗(yàn)。Zfp217的敲低明顯阻斷了脂肪生成，表現(xiàn)為油紅O染色水平下降，以及關(guān)鍵成脂基因PPARγ、aP2、LPL和脂聯(lián)素的表達(dá)水平降低。此外，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)完全敲除Zfp217基因后，3T3L1細(xì)胞中的脂肪生成完全被破壞。此外，他們還委托賽業(yè)生物（Cyagen）制備了Zfp217敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)Zfp217+/-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的脂肪生成減少。這些結(jié)果表明Zfp217對(duì)成脂分化有著重要的影響。

為了篩查Zfp217在3T3L1細(xì)胞中的功能，研究人員通過斑點(diǎn)印跡和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測了mRNA中的m6A修飾。與對(duì)照組相比，利用siRNA和CRISPR-Cas9系統(tǒng)處理后，3T3L1細(xì)胞中的m6A水平總體上增加（圖1）。與野生型細(xì)胞相比，Zfp217+/-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的m6A修飾也明顯增加。這些結(jié)果表明Zfp217對(duì)細(xì)胞m6A RNA甲基化至關(guān)重要。

圖1. Zfp217抑制導(dǎo)致3T3L1細(xì)胞中的m6A修飾增加

Zfp217直接激活FTO的轉(zhuǎn)錄

盡管Zfp217的失活影響了m6A修飾，但Zfp217本身并不是甲基轉(zhuǎn)移酶或去甲基化酶，那么Zfp217如何抑制m6A mRNA甲基化？于是，研究人員檢測了與m6A甲基化相關(guān)的關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。有意思的是，Zfp217被敲低后，甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的表達(dá)增高，而去甲基化酶FTO的表達(dá)降低。進(jìn)一步的研究表明，F(xiàn)TO的mRNA水平受到Zfp217過表達(dá)或敲低的調(diào)控。于是，他們想驗(yàn)證Zfp217是否作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控FTO的表達(dá)。

研究人員利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)來驗(yàn)證Zfp217增強(qiáng)了FTO的啟動(dòng)子活性，而FTO啟動(dòng)子上結(jié)合序列的缺失抑制了其活性，說明Zfp217對(duì)FTO的直接調(diào)控（圖2）。同時(shí)，F(xiàn)TO拯救了因缺乏Zfp217而造成的脂肪生成受阻，并增加了PPARγ、aP2、LPL和脂聯(lián)素的表達(dá)。這些結(jié)果表明，Zfp217作為轉(zhuǎn)錄因子與FTO基因的啟動(dòng)子結(jié)合，以增強(qiáng)脂肪生成。

圖2. Zfp217激活了FTO的轉(zhuǎn)錄

Zfp217與YTHDF2發(fā)生相互作用

之前的報(bào)道稱，Zfp217通過與胚胎發(fā)育和腫瘤中的其他蛋白質(zhì)相互作用而發(fā)揮其功能。為了進(jìn)一步探索Zfp217促進(jìn)脂肪生成的分子機(jī)制，研究人員又開展了免疫沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)。他們?cè)?T3L1細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了Zfp217和YTHDF2之間的特異性相互作用。

為了確認(rèn)亞細(xì)胞相互作用，他們分離出細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)組分來測定Zfp217和YTHDF2表達(dá)。他們發(fā)現(xiàn)，這兩種蛋白質(zhì)都分布在整個(gè)細(xì)胞中，不過Zfp217在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)比細(xì)胞核更多。此外，共聚焦顯微鏡分析也觀察到兩種蛋白質(zhì)同時(shí)位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，表明YTHDF2可能在Zfp217依賴的脂肪生成中發(fā)揮特定功能。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，YTHDF2在熱應(yīng)激下可通過抑制FTO活性來維持m6A的水平。于是，研究人員進(jìn)一步分析了YTHDF2和Zfp217與FTO之間的相互作用。正如預(yù)期，F(xiàn)TO和Zfp217的過表達(dá)都顯示出較低的m6A水平，且YTHDF2阻斷了FTO的去甲基化酶活性，而Zfp217作為調(diào)控因子，讓平衡傾向于去甲基化（圖3）。
 

圖3. Zfp217影響了YTHDF2和FTO之間的競爭

此外，他們通過m6A RNA pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)了FTO和YTHDF2在靶向m6A ssRNA上的直接競爭關(guān)系。顯然，不與RNA結(jié)合的Zfp217干擾YTHDF2的位置，讓FTO與RNA結(jié)合。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)也證明，Zfp217與YTHDF2發(fā)生相互作用，以維持FTO的m6A去甲基化活性。

總的來說，該研究證明ZFP217在轉(zhuǎn)錄（激活FTO）和轉(zhuǎn)錄后（影響mRNA m6A修飾）水平參與脂肪生成的重要作用，并發(fā)現(xiàn)創(chuàng)造性的提出了ZFP217影響m6A閱讀蛋白YTHDF2和擦除器FTO競爭性結(jié)合靶mRNA的作用模型，為深入了解m6A的動(dòng)態(tài)調(diào)控過程提出了新的思路。

圖4. Zfp217在脂肪生成中調(diào)控m6A修飾的示意圖

這是國際上首次報(bào)道RNA表觀修飾調(diào)控脂肪細(xì)胞生成的分子機(jī)制，是對(duì)脂肪細(xì)胞生成調(diào)控機(jī)制的全新認(rèn)識(shí)，對(duì)拓展相關(guān)研究領(lǐng)域具有重要意義。