養(yǎng)細(xì)胞中有小黑點(diǎn)，是碎片or污染，如何防范處理
養(yǎng)細(xì)胞中有小黑點(diǎn)，是碎片or污染？如何防范處理
相信很多養(yǎng)細(xì)胞的新手都遇到過(guò)，在養(yǎng)細(xì)胞中，細(xì)胞在顯微鏡下觀察小黑點(diǎn)，背景比較臟。遇到這樣的問(wèn)題又不知道怎么去辨別細(xì)胞情況�。�！
如果在顯微鏡下觀察到了小黑點(diǎn)，基本上可以將范圍縮小到是細(xì)菌污染還是細(xì)胞碎片。到底是污染還是碎片，可從以下幾個(gè)方面進(jìn)行判斷：
1、運(yùn)動(dòng)性：很多會(huì)動(dòng)的小黑點(diǎn)，只是發(fā)生布朗運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞碎片。從運(yùn)動(dòng)性上比較，浮躁的細(xì)菌活躍的多。
2、培養(yǎng)基的渾濁度：如果在顯微鏡下無(wú)法辨認(rèn)，那就交給時(shí)間吧。細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)于細(xì)菌來(lái)說(shuō)是非常營(yíng)養(yǎng)的大餐。一旦發(fā)生污染，細(xì)菌就會(huì)大量繁殖。培養(yǎng)基PH值迅速下降，培養(yǎng)基變黃且會(huì)變渾濁。通常在12小時(shí)內(nèi)就可以發(fā)現(xiàn)，而在48小時(shí)內(nèi)就非常明顯。被污染的細(xì)胞培養(yǎng)基變黃且渾濁、未被污染的細(xì)胞培養(yǎng)基偏紅且澄清。
3、接種平板：將懷疑污染物接種在微生物培養(yǎng)平板中，觀察菌落形成情況。碎片？細(xì)菌？一目了然。
對(duì)于養(yǎng)細(xì)胞的小伙伴，污染是避之唯恐不及，防范于未然更重要。
哪些步驟最容易發(fā)生污染？
最容易導(dǎo)致細(xì)菌污染的一個(gè)步驟就是細(xì)胞在水浴鍋解凍后沒(méi)有徹底消毒。如果這個(gè)步驟發(fā)生污染的話(huà)，細(xì)胞接種24小時(shí)之內(nèi)就會(huì)明顯觀察到細(xì)胞污染。另外幾個(gè)可能導(dǎo)致污染的操作是：放培養(yǎng)基的瓶子或者管子在用水浴鍋預(yù)熱后，沒(méi)有徹底消毒。實(shí)驗(yàn)員在操作過(guò)程中槍頭有可能接觸到被污染的部分而導(dǎo)致細(xì)胞污染。為了防止這種情況，容器外表面包括帽子應(yīng)噴灑75%乙醇徹底消毒，然后用無(wú)菌棉墊擦干。
實(shí)驗(yàn)員在操作過(guò)程中，移液器的槍尖可能會(huì)碰到超菌臺(tái)內(nèi)壁或者超菌臺(tái)內(nèi)放置的其他瓶子或設(shè)備，有時(shí)可能會(huì)碰到包含細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)瓶外表面，甚至?xí)龅绞痔祝蛘邔?shí)驗(yàn)操作服的袖口。以上所提到的任何一項(xiàng)操作失誤，都會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌污染。
保持無(wú)菌工作區(qū)是防止細(xì)胞污染的最佳方式：
1、使用前和使用后，用75%乙醇對(duì)所有工作表面進(jìn)行消毒。如果操作過(guò)程發(fā)生液體溢出的情況，這一項(xiàng)特別重要；
2、保持一個(gè)整潔的工作空間；工作區(qū)應(yīng)該只包含必須的實(shí)驗(yàn)設(shè)備；
3、在實(shí)驗(yàn)之前確保已經(jīng)準(zhǔn)備好所有需要的試劑和耗材，避免反復(fù)進(jìn)出操作區(qū)；
4、保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作在經(jīng)過(guò)徹底消毒的超菌工作臺(tái)或者生物安全柜中進(jìn)行。超凈工作臺(tái)或者生物安全柜可以通過(guò)紫外線和75%乙醇結(jié)合的方式消毒；
5、經(jīng)常清潔用于細(xì)胞培養(yǎng)的水浴鍋，經(jīng)常對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行消毒。
細(xì)胞碎片應(yīng)該怎么處理：
1、細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光，折光屬于細(xì)胞自身特性，無(wú)法清除也無(wú)法改變。
2、細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞已經(jīng)分泌的分泌泡，可以先換液后用PBS潤(rùn)洗清除，潤(rùn)洗不能清除的可以消化完成后加完全培養(yǎng)基終止消化，混勻細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5ml PBS重懸細(xì)胞，再離心后，用完全培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時(shí)碎片比較少，傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。
培養(yǎng)基污染應(yīng)該怎么處理
1、在使用前和使用后，用75%乙醇對(duì)培養(yǎng)基和其他試劑瓶子的外表面進(jìn)行消毒。此外，不要讓試劑瓶口敞開(kāi)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間；
2、盡可能將培養(yǎng)基和其他需要的試劑分裝。如果在在操作過(guò)程中發(fā)生錯(cuò)誤操作，最好不好再使用；
3、在操作培養(yǎng)基時(shí)，請(qǐng)使用一次性的塑料或者玻璃的無(wú)菌移液管。每個(gè)吸管只有一次，以避免交叉污染；
4、每天用顯微鏡觀察細(xì)胞，密切注意培養(yǎng)基的渾濁度；
5、避免和其他人共同使用培養(yǎng)基和其他試劑；
6、每個(gè)細(xì)胞系使用一瓶培養(yǎng)基。這樣可以有效避免交叉污染；
7、一次只操作一個(gè)細(xì)胞系，避免細(xì)胞之間的交叉污染；
細(xì)胞被污染了應(yīng)該怎么處理：
1、細(xì)菌污染
1.1、細(xì)菌污染的細(xì)胞，培養(yǎng)基會(huì)明顯渾濁，靜置后會(huì)在底部形成一層沙狀物，顯微鏡下觀察細(xì)胞被細(xì)菌包圍死亡。
1.2、細(xì)菌污染檢測(cè)，可以取細(xì)胞培養(yǎng)上清1ml左右，接種到3ml LB培養(yǎng)基，搖菌過(guò)夜。若培養(yǎng)基明顯變渾濁，則證明細(xì)菌污染；若無(wú)明顯變色，證明無(wú)污染。
1.3、細(xì)菌污染的細(xì)胞處理后及時(shí)丟棄，不會(huì)對(duì)其他細(xì)胞造成影響。
1.4、細(xì)胞碎片應(yīng)注意與細(xì)菌、真菌污染區(qū)分，主要區(qū)別在于細(xì)胞碎片不會(huì)明顯增殖，而細(xì)菌、真菌在過(guò)夜后即可明顯觀察到增殖，甚至完全遮蔽細(xì)胞。
1.5、細(xì)菌污染一般在污染源進(jìn)入后1-2天即可爆發(fā)，故發(fā)現(xiàn)污染時(shí)可以自行溯源。
2、真菌污染
2.1、真菌污染的細(xì)胞，顯微鏡下可以明顯看到樹(shù)枝狀霉菌菌絲或其他形態(tài)的菌體，肉眼可以看到明顯白色斑點(diǎn)或者培養(yǎng)基內(nèi)顆粒狀物質(zhì)漂浮。
2.2、真菌無(wú)須檢測(cè)，顯微鏡及肉眼即可分辨。
2.3、真菌污染的細(xì)胞，處理后及時(shí)丟棄，同時(shí)需要對(duì)培養(yǎng)箱及操作臺(tái)進(jìn)行消毒處理，避免污染其他細(xì)胞。
2.4、真菌污染一般在污染源進(jìn)入2-4天內(nèi)即可爆發(fā)，發(fā)現(xiàn)污染時(shí)可以自行溯源。
3、支原體污染
3.1、支原體污染在國(guó)內(nèi)是普遍存在的問(wèn)題，大部分實(shí)驗(yàn)室缺乏檢測(cè)及控制支原體污染的方法，導(dǎo)致有很大比例的細(xì)胞含有支原體污染。
3.2、支原體檢測(cè)方式多種多樣，PCR、熒光法、培養(yǎng)法、試劑盒等，不同實(shí)驗(yàn)方式檢測(cè)的靈敏度、特異性、針對(duì)的支原體類(lèi)型都不太一樣，所以各種檢測(cè)方法檢出結(jié)果有時(shí)會(huì)有出入。即同一個(gè)樣本，有的方法檢出陽(yáng)性，有的陰性，有的強(qiáng)有的弱。
3.3、支原體處理的，用6孔板培養(yǎng)，每天換液，細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)就傳代丟棄部分，基本可以保證2-3周清除干凈。
相信很多養(yǎng)細(xì)胞的新手都遇到過(guò)，在養(yǎng)細(xì)胞中，細(xì)胞在顯微鏡下觀察小黑點(diǎn)，背景比較臟。遇到這樣的問(wèn)題又不知道怎么去辨別細(xì)胞情況�。�！
如果在顯微鏡下觀察到了小黑點(diǎn)，基本上可以將范圍縮小到是細(xì)菌污染還是細(xì)胞碎片。到底是污染還是碎片，可從以下幾個(gè)方面進(jìn)行判斷：
1、運(yùn)動(dòng)性：很多會(huì)動(dòng)的小黑點(diǎn)，只是發(fā)生布朗運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞碎片。從運(yùn)動(dòng)性上比較，浮躁的細(xì)菌活躍的多。
2、培養(yǎng)基的渾濁度：如果在顯微鏡下無(wú)法辨認(rèn)，那就交給時(shí)間吧。細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)于細(xì)菌來(lái)說(shuō)是非常營(yíng)養(yǎng)的大餐。一旦發(fā)生污染，細(xì)菌就會(huì)大量繁殖。培養(yǎng)基PH值迅速下降，培養(yǎng)基變黃且會(huì)變渾濁。通常在12小時(shí)內(nèi)就可以發(fā)現(xiàn)，而在48小時(shí)內(nèi)就非常明顯。被污染的細(xì)胞培養(yǎng)基變黃且渾濁、未被污染的細(xì)胞培養(yǎng)基偏紅且澄清。
3、接種平板：將懷疑污染物接種在微生物培養(yǎng)平板中，觀察菌落形成情況。碎片？細(xì)菌？一目了然。
對(duì)于養(yǎng)細(xì)胞的小伙伴，污染是避之唯恐不及，防范于未然更重要。
哪些步驟最容易發(fā)生污染？
最容易導(dǎo)致細(xì)菌污染的一個(gè)步驟就是細(xì)胞在水浴鍋解凍后沒(méi)有徹底消毒。如果這個(gè)步驟發(fā)生污染的話(huà)，細(xì)胞接種24小時(shí)之內(nèi)就會(huì)明顯觀察到細(xì)胞污染。另外幾個(gè)可能導(dǎo)致污染的操作是：放培養(yǎng)基的瓶子或者管子在用水浴鍋預(yù)熱后，沒(méi)有徹底消毒。實(shí)驗(yàn)員在操作過(guò)程中槍頭有可能接觸到被污染的部分而導(dǎo)致細(xì)胞污染。為了防止這種情況，容器外表面包括帽子應(yīng)噴灑75%乙醇徹底消毒，然后用無(wú)菌棉墊擦干。
實(shí)驗(yàn)員在操作過(guò)程中，移液器的槍尖可能會(huì)碰到超菌臺(tái)內(nèi)壁或者超菌臺(tái)內(nèi)放置的其他瓶子或設(shè)備，有時(shí)可能會(huì)碰到包含細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)瓶外表面，甚至?xí)龅绞痔祝蛘邔?shí)驗(yàn)操作服的袖口。以上所提到的任何一項(xiàng)操作失誤，都會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌污染。
保持無(wú)菌工作區(qū)是防止細(xì)胞污染的最佳方式：
1、使用前和使用后，用75%乙醇對(duì)所有工作表面進(jìn)行消毒。如果操作過(guò)程發(fā)生液體溢出的情況，這一項(xiàng)特別重要；
2、保持一個(gè)整潔的工作空間；工作區(qū)應(yīng)該只包含必須的實(shí)驗(yàn)設(shè)備；
3、在實(shí)驗(yàn)之前確保已經(jīng)準(zhǔn)備好所有需要的試劑和耗材，避免反復(fù)進(jìn)出操作區(qū)；
4、保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作在經(jīng)過(guò)徹底消毒的超菌工作臺(tái)或者生物安全柜中進(jìn)行。超凈工作臺(tái)或者生物安全柜可以通過(guò)紫外線和75%乙醇結(jié)合的方式消毒；
5、經(jīng)常清潔用于細(xì)胞培養(yǎng)的水浴鍋，經(jīng)常對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行消毒。
細(xì)胞碎片應(yīng)該怎么處理：
1、細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光，折光屬于細(xì)胞自身特性，無(wú)法清除也無(wú)法改變。
2、細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞已經(jīng)分泌的分泌泡，可以先換液后用PBS潤(rùn)洗清除，潤(rùn)洗不能清除的可以消化完成后加完全培養(yǎng)基終止消化，混勻細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5ml PBS重懸細(xì)胞，再離心后，用完全培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時(shí)碎片比較少，傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。
培養(yǎng)基污染應(yīng)該怎么處理
1、在使用前和使用后，用75%乙醇對(duì)培養(yǎng)基和其他試劑瓶子的外表面進(jìn)行消毒。此外，不要讓試劑瓶口敞開(kāi)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間；
2、盡可能將培養(yǎng)基和其他需要的試劑分裝。如果在在操作過(guò)程中發(fā)生錯(cuò)誤操作，最好不好再使用；
3、在操作培養(yǎng)基時(shí)，請(qǐng)使用一次性的塑料或者玻璃的無(wú)菌移液管。每個(gè)吸管只有一次，以避免交叉污染；
4、每天用顯微鏡觀察細(xì)胞，密切注意培養(yǎng)基的渾濁度；
5、避免和其他人共同使用培養(yǎng)基和其他試劑；
6、每個(gè)細(xì)胞系使用一瓶培養(yǎng)基。這樣可以有效避免交叉污染；
7、一次只操作一個(gè)細(xì)胞系，避免細(xì)胞之間的交叉污染；
細(xì)胞被污染了應(yīng)該怎么處理：
1、細(xì)菌污染
1.1、細(xì)菌污染的細(xì)胞，培養(yǎng)基會(huì)明顯渾濁，靜置后會(huì)在底部形成一層沙狀物，顯微鏡下觀察細(xì)胞被細(xì)菌包圍死亡。
1.2、細(xì)菌污染檢測(cè)，可以取細(xì)胞培養(yǎng)上清1ml左右，接種到3ml LB培養(yǎng)基，搖菌過(guò)夜。若培養(yǎng)基明顯變渾濁，則證明細(xì)菌污染；若無(wú)明顯變色，證明無(wú)污染。
1.3、細(xì)菌污染的細(xì)胞處理后及時(shí)丟棄，不會(huì)對(duì)其他細(xì)胞造成影響。
1.4、細(xì)胞碎片應(yīng)注意與細(xì)菌、真菌污染區(qū)分，主要區(qū)別在于細(xì)胞碎片不會(huì)明顯增殖，而細(xì)菌、真菌在過(guò)夜后即可明顯觀察到增殖，甚至完全遮蔽細(xì)胞。
1.5、細(xì)菌污染一般在污染源進(jìn)入后1-2天即可爆發(fā)，故發(fā)現(xiàn)污染時(shí)可以自行溯源。
2、真菌污染
2.1、真菌污染的細(xì)胞，顯微鏡下可以明顯看到樹(shù)枝狀霉菌菌絲或其他形態(tài)的菌體，肉眼可以看到明顯白色斑點(diǎn)或者培養(yǎng)基內(nèi)顆粒狀物質(zhì)漂浮。
2.2、真菌無(wú)須檢測(cè)，顯微鏡及肉眼即可分辨。
2.3、真菌污染的細(xì)胞，處理后及時(shí)丟棄，同時(shí)需要對(duì)培養(yǎng)箱及操作臺(tái)進(jìn)行消毒處理，避免污染其他細(xì)胞。
2.4、真菌污染一般在污染源進(jìn)入2-4天內(nèi)即可爆發(fā)，發(fā)現(xiàn)污染時(shí)可以自行溯源。
3、支原體污染
3.1、支原體污染在國(guó)內(nèi)是普遍存在的問(wèn)題，大部分實(shí)驗(yàn)室缺乏檢測(cè)及控制支原體污染的方法，導(dǎo)致有很大比例的細(xì)胞含有支原體污染。
3.2、支原體檢測(cè)方式多種多樣，PCR、熒光法、培養(yǎng)法、試劑盒等，不同實(shí)驗(yàn)方式檢測(cè)的靈敏度、特異性、針對(duì)的支原體類(lèi)型都不太一樣，所以各種檢測(cè)方法檢出結(jié)果有時(shí)會(huì)有出入。即同一個(gè)樣本，有的方法檢出陽(yáng)性，有的陰性，有的強(qiáng)有的弱。
3.3、支原體處理的，用6孔板培養(yǎng)，每天換液，細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)就傳代丟棄部分，基本可以保證2-3周清除干凈。
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