中國微生物菌種查詢網(wǎng)  在抗體研究的漫長過程中,相繼發(fā)展了三代不同水平的抗體制備技術(shù)｡其中以抗原免疫高等脊椎動(dòng)物制備的多克隆抗體,稱為第一代抗體;通過雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的只針對(duì)某一種特定抗原決定簇的單克隆抗體,稱為第二代抗體;應(yīng)用重組DNA技術(shù)或是基因突變的方法改造某種抗體基因的編碼序列,使之產(chǎn)生出自然界中原本存在的抗體蛋白質(zhì)分子叫做基因工程抗體,即第三代抗體｡這種基因工程稱為抗體工程｡
Kohler等于1975年創(chuàng)立的B淋巴細(xì)胞雜交瘤單克隆抗體技術(shù),使抗體技術(shù)的研究和應(yīng)用有了重大突破｡該技術(shù)已在疾病的研究､診斷､治療中得到了廣泛的應(yīng)用｡盡管如此,單克隆抗體作為異種蛋白,應(yīng)用于機(jī)體會(huì)受到免疫系統(tǒng)的限制,產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答｡另外,雜交瘤技術(shù)還有許多不足之處,如生產(chǎn)的單抗分子體積過大,與靶抗原的親和力不夠,不同的抗原需要單獨(dú)接種單抗,細(xì)胞融合技術(shù)難度高､效率低｡最主要的是,單克隆抗體應(yīng)用于人體疾病治療時(shí),使用單抗兩周內(nèi)就會(huì)對(duì)其產(chǎn)生免疫反應(yīng)｡這使得傳統(tǒng)單克隆抗體技術(shù)制備的抗體在應(yīng)用上受到了極大的制約,無法充分發(fā)揮其在疾病防控方面的作用｡因此,基因工程技術(shù)及抗體分子遺傳學(xué)應(yīng)運(yùn)而生,并得到了進(jìn)一步的發(fā)展｡在20世紀(jì)80年代中期出現(xiàn)新技術(shù)將免疫球蛋白的基因結(jié)構(gòu)和功能同DNA重組技術(shù)結(jié)合起來,再將重組后的免疫球蛋白分子基因?qū)�入�?xì)胞進(jìn)行表達(dá)｡由該技術(shù)所得的抗體去除或減少了無關(guān)結(jié)構(gòu),保留(或增加)了天然抗體的特異性和生物學(xué)活性,降低或基本消除抗體的免疫原性,減低抗體中鼠源成分的同時(shí)保留原有抗體的特異性｡對(duì)現(xiàn)有的優(yōu)良鼠單抗基因進(jìn)行改造,所得的抗體人源化程度高,生產(chǎn)工藝簡單,廉價(jià)易得,且容易獲得稀有抗體,臨床應(yīng)用前景廣闊｡
1984年,Morrison等創(chuàng)立了鼠/人嵌合抗體技術(shù),該技術(shù)使得基因工程抗體技術(shù)得到了進(jìn)一步的發(fā)展｡在第三代抗體中主要包括人源化抗體､小分子抗體､抗體融合蛋白及某些特殊類型抗體等,從一定程度克服了前兩代抗體技術(shù)的不足｡另外,噬菌體抗體庫､核糖體展示文庫等的構(gòu)建使得不經(jīng)抗原免疫就可獲得特異性抗體｡
1､人源化的基因工程抗體
人們?cè)缙谠鴩L試用人雜交瘤細(xì)胞來生產(chǎn)人單克隆抗體,但是由于人雜交瘤細(xì)胞的不穩(wěn)定性､人單克隆抗體的低親和力和倫理爭議等方面的原因?qū)е略摷夹g(shù)很少被應(yīng)用｡
1.1､嵌合抗體
降低鼠源單克隆抗體免疫原性的一種方法是將鼠免疫球蛋白的可變區(qū)部分鏈接到相應(yīng)的人免疫球蛋白的恒定區(qū),這樣就產(chǎn)生了鼠/人嵌合抗體,人源區(qū)域在60%~70%｡應(yīng)用重組DNA技術(shù),將鼠源單抗的可變區(qū)基因與人的恒定區(qū)基因連接,構(gòu)建的嵌合基因插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染相應(yīng)的細(xì)胞后表達(dá)｡所產(chǎn)生的嵌合抗體具有結(jié)合抗原的功能,同時(shí)降低了鼠源單抗的異源性,這樣的嵌合抗體在親和力方面與相應(yīng)的鼠單抗沒有太大的差異,而人對(duì)它的免疫反應(yīng)會(huì)有所降低｡但由于其仍然保留了鼠免疫球蛋白可變區(qū)的異源性,臨床實(shí)驗(yàn)證明該嵌合抗體在應(yīng)用時(shí)還會(huì)產(chǎn)生人抗嵌合抗體(HACA)可變區(qū)的免疫反應(yīng)｡
1.2､人化抗體
為了降低嵌合抗體的免疫原性,使嵌合抗體更加人源化,產(chǎn)生了CDR嫁接技術(shù)｡該技術(shù)將免疫球蛋白的其他區(qū)域都用人免疫球蛋白取代,而僅僅保留鼠免疫球蛋白可變區(qū)的CDR部分,這就最大限度地降低鼠源抗體的免疫原性｡這樣產(chǎn)生的抗體叫做人化抗體或改形抗體｡這樣的操作往往需要復(fù)雜的DNA操作,并且有些病人也會(huì)產(chǎn)生針對(duì)異源CDR的免疫反應(yīng)｡為了降低這種反應(yīng),只有CDR中最具特異性的氨基酸殘基部分才能被嫁接到人抗體的骨架部分｡盡管抗體的親和力主要取決于CDR,但是抗體的其他部分也會(huì)對(duì)親和力產(chǎn)生影響｡為了在免疫球蛋白改形后仍然保持原有的親和力,還需要對(duì)免疫球蛋白骨架區(qū)進(jìn)行改進(jìn)｡
2､小分子抗體
為了突破單克隆抗體過大帶來的限制,發(fā)展了小分子抗體的技術(shù)｡這些技術(shù)的目標(biāo)是獲得抗體的抗原結(jié)合片段(Fab)和抗體的可變區(qū)(Fv)｡這樣的片段可以通過對(duì)抗體的裂解得到,也可以通過擴(kuò)增免疫球蛋白的相關(guān)基因并在細(xì)菌內(nèi)克隆表達(dá)而得到｡小分子抗體分子量小､穿透性強(qiáng)､免疫原性低､半衰期短,目前研究較多和比較有實(shí)用前景的有以下幾種｡
2.1､單鏈抗體(scFv)
該技術(shù)將重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)用一連接肽連接,并利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)成一條單鏈多肽并折疊成由重鏈､輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的一種新型抗體｡該抗體大小僅為完整IgG的1/6,同時(shí)抗原結(jié)合位點(diǎn)沒有發(fā)生變化,因此保留了完整的結(jié)合特異性｡基于這一優(yōu)勢(shì),ScFv具有更好的組織穿透力,能夠進(jìn)入一般抗體無法到達(dá)的部位,在臨床應(yīng)用及疾病治療中能夠得到更好的應(yīng)用｡另外,單鏈抗體擁有多肽接頭,可根據(jù)需要設(shè)計(jì)為具有特殊功能的位點(diǎn),如金屬鰲合､連接毒素或藥物等,用于影像和臨床治療｡
2.2､多價(jià)抗體
該抗體的多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)具有不同的特異性,能夠結(jié)合不同的抗原分子,改變了傳統(tǒng)抗體只能結(jié)合單一抗原分子的不足｡目前研究人員關(guān)注較多的是雙特異性單克隆抗體(BsAb)｡應(yīng)用基因工程與化學(xué)偶聯(lián)技術(shù),把識(shí)別不同抗原的兩種抗體的編碼序列進(jìn)行重新排列,生產(chǎn)出可同時(shí)與兩種抗原作特異性結(jié)合的新型重組抗體,即雙特異性單克隆抗體｡在這種抗體中,兩條臂分別識(shí)別兩種不同的抗原,因此構(gòu)建出既能同腫瘤細(xì)胞表面抗原結(jié)合,又能同殺傷性T細(xì)胞表面抗原結(jié)合的雙特異性的單克隆抗體｡這使兩種不同的細(xì)胞彼此靠近,從而有利于殺傷性T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的致死作用｡
2.3､Fab片段
在抗體中,Fab段主要起到結(jié)合抗原的作用,而利用基因工程的方法,將Fd基因與輕鏈基因5′端通過鏈間二硫鍵連接,并接上細(xì)菌的信號(hào)序列｡表達(dá)后的蛋白在信號(hào)肽酶的作用下被剪除信號(hào)肽并完成立體折疊等步驟成為異二聚體,發(fā)揮正常Fab的功能｡該抗體僅為IgG的1/3,且沒有Fc段,免疫原性低,具有良好的穿透力,常用作導(dǎo)向藥物的載體和顯影｡
3､噬菌體抗體技術(shù)
20世紀(jì)90年代初,在PCR技術(shù)､抗體Fab片段在大腸桿菌中的表達(dá)及噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)快速發(fā)展的基礎(chǔ)上,出現(xiàn)了基于分子生物學(xué)方法建立的抗體庫技術(shù)｡其中,噬菌體抗體庫技術(shù)表現(xiàn)更為優(yōu)越｡
噬菌體抗體(PhAb)技術(shù)的基本程序是:用PCR方法擴(kuò)增全套抗體可變區(qū)基因或抗體片段(Fab､Fv或scFv)基因,并與噬菌體衣殼蛋白基因連接后轉(zhuǎn)入載體中,它能夠與絲狀噬菌體的外殼蛋白形成融合蛋白,將抗體Fab段或單鏈抗體表達(dá)在噬菌體表面,然后通過抗原的親和篩選從眾多的抗體中得到特異性明確的抗體及其編碼基因｡該技術(shù)繞過細(xì)胞雜交環(huán)節(jié),不再使用小鼠進(jìn)行免疫得到抗體,在數(shù)周內(nèi)就能夠得到特異的人抗體基因而生產(chǎn)人源化抗體｡用B淋巴細(xì)胞全套抗體可變區(qū)基因克隆并組裝成的噬菌體群體稱之為噬菌體抗體庫｡根據(jù)抗體片段大小的不同,抗體庫可分為Fab庫､單鏈抗體(scFv)庫､單域抗體庫､diabody庫､dsFv庫和minibody庫等｡scFv和單域抗體分子小､穿透力強(qiáng)､體內(nèi)半衰期短､免疫原性低｡diabody與minibody都是雙價(jià)抗體,其與抗原的結(jié)合能力遠(yuǎn)高于單鏈抗體,是較理想的免疫顯像和治療用抗體形式｡
該技術(shù)操作簡單､無需細(xì)胞雜交或復(fù)雜的PCR技術(shù)､周期短､花費(fèi)少;利用不同的抗原可同時(shí)篩選幾種抗體,并可在百萬至億萬個(gè)分子中進(jìn)行選擇;適用于抗體､激素､酶､藥物､隨機(jī)多肽等蛋白的制備,更為令人關(guān)注的是,該技術(shù)能得到由于免疫耐受機(jī)制的影響導(dǎo)致免疫動(dòng)物不能產(chǎn)生的抗體｡噬菌體抗體技術(shù)極大地推動(dòng)了基因工程抗體的發(fā)展,它們的產(chǎn)生為人類及動(dòng)物疾病的預(yù)防､診斷和治療帶來了新的希望｡
4､核糖體展示技術(shù)與mRNA展示技術(shù)
核糖體展示技術(shù)的關(guān)鍵步驟在于,利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建ScFv抗體基因文庫,然后轉(zhuǎn)錄成mRNA;在大腸桿菌等體外表達(dá)系統(tǒng)中翻譯､表達(dá),最終以固化的抗原進(jìn)行親和篩選,從翻譯后的mRNA-ScFv復(fù)合物中得到高親和力的ScFv｡改進(jìn)后的RD技術(shù),由于mRNA上沒有任何終止密碼子,翻譯過程中蛋白和編碼它的mRNA同時(shí)結(jié)合在核糖體上,形成了蛋白-mRNA-核糖體復(fù)合物,使得蛋白的表型及基因型以這種復(fù)合物的形式偶聯(lián),經(jīng)過展示后,篩選蛋白能夠被富集100~1000倍｡該技術(shù)不使用任何細(xì)胞,因此相較于其他技術(shù),效率得到了明顯的提高,極大的縮短了實(shí)驗(yàn)周期,便捷､快速｡
1997年Roberts等設(shè)計(jì)了一種與RD類似的方法,即mRNA展示技術(shù)(mRNAdisplay,又稱RNA-多肽融合技術(shù),RNA-peptidefusion)｡該系統(tǒng)利用嘌呤霉素分子將mRNA分子與其所編碼的多肽共價(jià)結(jié)合起來,先將嘌呤霉素與單鏈DNA連接物的3′端連結(jié),再與文庫編碼的mRNA連結(jié)｡這樣,當(dāng)mRNA在體外翻譯時(shí),核糖體到達(dá)mRNA和DNA的結(jié)合點(diǎn)并穩(wěn)定下來,嘌呤霉素進(jìn)入核糖體氨�；�位點(diǎn),在氨酰轉(zhuǎn)移酶的作用下與所編碼的多肽偶聯(lián),再用固化的抗原分子對(duì)RNA-多肽復(fù)合物進(jìn)行篩選｡
5､轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)
近年來,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)飛速發(fā)展,其應(yīng)用范圍也越來越廣｡例如,鼠胚胎干細(xì)胞的IgH和Igκ位點(diǎn)在利用同源性重組技術(shù)刪除JH和Cκ區(qū)而滅活后,能夠達(dá)到宿主動(dòng)物相應(yīng)基因沉默的目的｡分別刪除這兩個(gè)區(qū)域的小鼠雜交而得的后代JH-/-和Cκ-/-兩基因被滅活,然后將人抗體基因克隆到酵母人工染色體上,并整合入該種小鼠的胚胎細(xì)胞,這樣的細(xì)胞經(jīng)顯微注射入母體后得到含人抗體IgH和Igκ位點(diǎn)序列的雜交后代｡經(jīng)免疫后,這些雜交鼠產(chǎn)生的人源抗體親和力高,特異性好,使用效果及安全性得到了較大的提高,對(duì)自身免疫性疾病､癌癥等慢性病的治療效果優(yōu)異｡ 
6､轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)
與哺乳動(dòng)物細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生抗體比較,植物抗體(Plantibody)具有價(jià)廉､高效､安全等優(yōu)點(diǎn)｡1995年Ma等制備了一種產(chǎn)生于煙草植物中的抗體———分泌型二聚體IgA/G(SIgA/G),能識(shí)別變異鏈球菌細(xì)胞表面蛋白｡經(jīng)研究證明,該抗體可用于治療齒齲病,還可防止變異鏈球菌定居口腔,效用可持續(xù)4個(gè)月｡2002年,Bouquin等在轉(zhuǎn)基因芥類植物細(xì)胞中成功制備了抗RhD抗原的人源化IgG1抗體,經(jīng)研究表明該抗體具有廣闊的診斷及治療應(yīng)用前景｡
抗體制備技術(shù)在基因工程抗體技術(shù)的發(fā)展過程中進(jìn)入了一個(gè)全新的時(shí)代,可廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)中的許多領(lǐng)域,對(duì)于病毒性疾病､器官移植､腫瘤､自身免疫性疾病､中毒性疾病､變態(tài)反應(yīng)性疾病等方面具有重要的作用｡這些技術(shù)使制備抗體變得簡單便捷､穩(wěn)定廉價(jià),為大規(guī)模的應(yīng)用提供了良好的基礎(chǔ)｡另外,所得的抗體在蛋白質(zhì)純化工程中也能夠得到廣泛的應(yīng)用｡隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,基因工程抗體技術(shù)將在疾病預(yù)防､診斷及治療上得到越來越多的應(yīng)用,這為提高人類生活質(zhì)量提供強(qiáng)有力的支持｡