植物組織膜性囊泡（RSOV和IOV）制備試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）
 
主要用途
 
植物組織膜性囊泡（RSOV和IOV）制備試劑是一種旨在通過差速離心技術(shù)從植物組織中分離出各種正常外向膜性囊泡（Right-side out；RSOV）和內(nèi)側(cè)外翻膜性囊泡（In-side out；IOV）組分的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種植物組織，包括種子（seed）、葉片（leaf）、根（root）、胚胎葉（cotyledon）、上胚軸（epicotyl）等膜性囊泡的制備。其制備物產(chǎn)量高，可以被用于膜通道、信號傳導(dǎo)機(jī)制、膜蛋白分布等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量和純度俱佳。
 
技術(shù)背景
 
膜性囊泡（membrane vesicle）分成正常外向膜性囊泡（Right-side out；RSOV）和內(nèi)側(cè)外翻膜性囊泡（In-side out；IOV）。正常外向膜性囊泡是通過去除細(xì)胞漿內(nèi)容物，使之失去細(xì)內(nèi)在的代謝系統(tǒng)，同時(shí)保持質(zhì)膜的原始位相，有利于提供適合的底物，不會受到降解和代謝，建立動(dòng)力機(jī)制，進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)或攝入研究，例如微粒體組分用于V型ATP酶研究、線粒體組分用于F型ATP酶研究。而內(nèi)側(cè)外翻膜性囊泡是通過裂解細(xì)胞和細(xì)胞器后，質(zhì)膜重新閉合形成內(nèi)側(cè)面外翻的囊泡狀結(jié)構(gòu)，廣泛用于原發(fā)性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的研究。 
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
清理液（Reagent A）    100毫升
平衡液（Reagent B）     60毫升
保存液（Reagent C）     20毫升
產(chǎn)品說明書   1份
 
保存方式
 
保存保存液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月
 
用戶自備
 
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器
4℃超速離心機(jī)：用于分離膜性囊泡
DOUNCE勻漿器：用于裂解組織
 
實(shí)驗(yàn)步驟
 
一、正常外向膜性囊泡分離（線粒體和微粒體）
 

• 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入一個(gè)液氮凍存管
• 即刻放入液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
• 加入3毫升預(yù)冷的平衡液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移出上清液到2個(gè)新的1.5毫升離心管，同時(shí)保留沉淀顆粒
• 加入500微升保存液（Reagent C）到沉淀顆粒管――此為線粒體RSOV組分（注意：可用于F型ATP酶研究）
• 將含有上清液的2個(gè)1.5毫升離心管放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心60分鐘，速度為100000g
• 小心抽去上清液
• 分別加入500微升保存液（Reagent C）――此為微粒體RSOV組分（注意：可用于V型ATP酶研究）
• 移取10微升進(jìn)行蛋白質(zhì)定量測定（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃冰箱里保存

 
二、內(nèi)側(cè)外翻膜性囊泡分離（質(zhì)膜分離）
 

• 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入一個(gè)液氮凍存管
• 即刻放入液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
• 加入3毫升預(yù)冷的平衡液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心30分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升保存液（Reagent C）――此為質(zhì)膜RSOV組分（注意：可用于P型ATP酶研究）
• 連續(xù)－70℃至37℃凍融4次――此為質(zhì)膜IOV組分
• 移取10微升進(jìn)行蛋白質(zhì)定量測定（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃冰箱里保存
• （選擇步驟）進(jìn)行IOV組分純化（建議使用 IOV膜性囊泡高質(zhì)純化試劑盒－10170）

 
注意事項(xiàng)
 

• 本產(chǎn)品為20次（1克植物組織）操作
• 所有操作均須在4℃或以下狀態(tài)進(jìn)行
• 建議使用足夠的樣品量
• 通常1克植物組織的微粒體組分含量為50毫克蛋白，線粒體組分含量5毫克蛋白，100毫克質(zhì)膜

5． 質(zhì)膜IOV組分為粗提分離產(chǎn)物，其中含有RSOV和未予閉合的質(zhì)膜不等，如果需要獲得95％以上的高純度的IOV，建議使用 IOV膜性囊泡高質(zhì)純化試劑盒－10170
6． 純化的樣品避免反復(fù)凍融  

• 本公司提供系列離子膜通道轉(zhuǎn)運(yùn)功能（transport/uptake）分析試劑產(chǎn)品

 
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離組分維持正常活性
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶