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lncRNA促進胃癌進展的新機制研究思路分析

瀏覽次數(shù)：2874　發(fā)布日期：2018-8-7　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

Nature子刊|聯(lián)合南京醫(yī)科大發(fā)表重要研究成果：揭示lncRNA促進胃癌進展的新機制

近日，南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院的束永前團隊將最新的研究成果，以題為“Upregulation of the long noncoding RNA FOXD2-AS1 promotes carcinogenesis by epigenetically silencing EphB3 through EZH2 and LSD1, and predicts poor prognosis in gastric cancer”發(fā)表于著名學術期刊《Oncogene》（影響因子：6.854）。該研究發(fā)現(xiàn)了促進胃癌進展的重要lncRNA FOXD2-AS1，并且揭示FOXD2-AS1通過EZH2和LSD1與目標基因結合而誘導轉錄沉默的新機制。FOXD-AS1通過EZH2和LSD1介導EphB3下調促進胃癌發(fā)生。這些結果表明在胃癌發(fā)生過程中FOXD2-AS1可以通過與EZH2和LSD1發(fā)生直接相互作用抑制EphB3發(fā)揮腫瘤誘導因子的作用，因此該分子或可成為檢測癌癥發(fā)生的新標志物。

研究背景：

Long noncoding RNAs (lncRNAs)是一組無蛋白編碼潛能，大小超過200個核苷酸的非編碼RNA。許多研究表明，lncRNA在不同的分子通路中發(fā)揮關鍵的調節(jié)作用，特異性的lncRNA與腫瘤的發(fā)生有關，例如FENDRR、TINCR和GAPLINC，并且在胃癌細胞中l(wèi)ncRNA異常富集。數(shù)據(jù)顯示，多種腫瘤相關的lncRNA通過與甲基轉移酶EZH2和去甲基化酶LSD1相互作用調節(jié)癌癥進展。

胃癌（GC）是世界上排名第四的惡性腫瘤，在東亞地區(qū)發(fā)病率較高，大多數(shù)病例由于早期無特定的癥狀而被診斷為晚期。此外，由于對胃癌發(fā)生的分子和遺傳機制知之甚少，治療方案也很有限。認識到遺傳和表觀遺傳失調與腫瘤發(fā)生有關，識別新的診斷和預后生物標志物，對預測胃癌的發(fā)生具有很好的應用前景。

研究思路：

此次云序生物和南京醫(yī)科大的研究團隊對FOXD2-AS1在胃癌進展中發(fā)揮的功能以及調控的相關生物學機制進行了深入研究，其思路和方法值得我們借鑒。本研究中，首先比較了GEO數(shù)據(jù)庫中GC和正常胃組織的lncRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)了一種新的lncRNA FOXD2-AS1在GC中顯著過表達。深入分析發(fā)現(xiàn)FOXD2-AS1在GC中的上調與腫瘤大小、癌癥發(fā)展階段以及不良預后存在正相關關系。RACE分析和Sanger測序表明，該轉錄本增加了兩個外顯子。GO和GSEA分析顯示其與細胞周期和DNA復制顯著相關，F(xiàn)OXD2-AS1的敲除和過表達進一步驗證了生信分析結果。RIP和RNA pull down結果表明FOXD2-AS1與EZH2和LSD1蛋白結合。WB結合IHC證實了FOXD2-AS1與EphB3的相關性，并且利用ChIP、qChIP和ChIRP技術結合流式細胞術以及生信分析的手段，證明FOXD2-AS1通過將EZH2和LSD1引入到EphB3的啟動子中，抑制其轉錄。至此，成功揭示了FOXD2-AS1通過EZH2和LSD1介導的EphB3下調促進胃癌發(fā)生的新機制。

圖1.技術路線圖

研究內容：

1. LncRNA在GC中的表達譜

研究者利用現(xiàn)有芯片數(shù)據(jù)分析26對癌癥和非癌組織發(fā)現(xiàn)lncRNAs中41個表達上調，71個表達下調，其中H19，UCA1，PVT1和FOXD2-AS1在胃癌中上調顯著。為了評價lncRNA在GC中的作用，我們選擇了FOXD2-AS1，顯著P-Values和False discovery rate (FDR)分析表明FOXD2-AS1在GC組織中上調最為顯著。RACE分析和Sanger測序揭示其全聚（A）陽性序列和基因大�。�3057bp）。UCSC和CPC分析證實FOXD2-AS1沒有蛋白編碼能力。檢測106例受試者中FOXD2-AS1的表達水平，對比癌組織/癌旁組織（T/N）比值，結果顯示FOXD2-AS1在GC組織中的表達量約70%。RT-qPCR驗證發(fā)現(xiàn)多種胃癌組織中FOXD2-AS1富集顯著增加。并且FOXD2-AS1的表達水平與腫瘤大小、浸潤性及腫瘤階段呈正相關。

圖2. GC中l(wèi)ncRNA表達譜分析

2. GC細胞中FOXD2-AS1富集高的患者預后較差

在芯片數(shù)據(jù)GSE51575基礎上，以正常組織作為對照，來評估FOXD2-AS1的診斷效果。ROC曲線下面積為0.919（95%置信區(qū)間[CI] 0.809-0.976; P < 0.0001）;特異性和敏感性分別為0.885和0.885。此外，發(fā)現(xiàn)區(qū)分腫瘤組織的臨界值為10.925（△Ct）和AUC為0.709（95% CI 0.643 -0.769; P < 0.0001），特異性和敏感性分別為0.726和0.632。利用Kaplan-Meier (K-M)曲線和log-rank方法分析FOXD2-AS1富集與無病生存(DFS)之間的相關性，發(fā)現(xiàn)高富集FOXD2-AS1的患者比低富集FOXD2-AS1的患者預后差。

圖3. FOXD2-AS1與GC患者預后關系

3. FOXD2-AS1是體外和體內的腫瘤誘導因子

為了評估FOXD2-AS1是否能促進GC進展，基于芯片數(shù)據(jù)GSE51575進行GSEA分析，結果顯示，細胞周期和DNA復制兩個增殖指標與高FOXD2-AS1表達組和低FOXD2-AS1表達組的基因特征最為相關。GO分析揭示了在FOXD2- AS1敲除的細胞中與細胞周期和DNA復制相關的基因的變化。此外，采用qPCR和WB檢測發(fā)現(xiàn)FOXD2-AS1富集變化顯著改變了腫瘤發(fā)生的關鍵基因的特征，提示FOXD2-AS1可能是胃腫瘤發(fā)生的關鍵調控因子。采用基因沉默和過表達的方法，揭示在裸鼠中FOXD2-AS1功能缺失能夠抑制胃癌細胞的細胞周期進程，而FOXD2-AS1的表達上調能夠促進癌癥進展。

圖4. FOXD2-AS1對GC進展的影響

4. FOXD2-AS1通過與EZH2、LSD1相互作用改變EphB3表達

既往研究表明，lncRNA通過RNA結合蛋白調控下游因子，是否FOXD2-AS1介導的調控同樣通過類似的機制發(fā)生，研究者利用生物信息學方法結合RIP測序、RNA pull down技術最終驗證了FOXD2-AS1通過與甲基轉移酶EZH2和去甲基化酶LSD1的結合在GC細胞中發(fā)揮重要的調控作用。從RNA測序數(shù)據(jù)來看，F(xiàn)OXD2-AS1減少時，EphB3表達增加。敲除FOXD2-AS2后，發(fā)現(xiàn)EphB3表達顯著增加，而異位FOXD2-AS1表達降低了EphB3 mRNA的富集。WB證實了FOXD2-AS1的敲除和過表達在GC細胞中分表上調和下調了EphB3的水平。為了確定FOXD2- AS1是否通過將EZH2和LSD1招募到GC中的EphB3啟動子區(qū)來抑制轉錄，這里進行了功能的敲除和回補實驗以及ChIP檢測，發(fā)現(xiàn)EZH2和LSD1沉默后，EphB3上調。FOXD2-AS1的敲除降低了GC細胞的結合能力和誘導的修飾，而對照細胞則通過重組shRNA進行轉染。為了觀察FOXD2-AS1是否直接作用于靶色素，我們利用ChIRP方法分離染色質，分析了FOXD2-AS1依賴的EZH2/LSD1靶基因EphB3的位點，并使用qPCR檢測。ChIRP結果顯示FOXD2-AS1被招募到GC細胞的EphB3啟動子中。最后，在GC組織中評估EphB3表達，與FOXD2-AS1呈反比關系，同時，F(xiàn)OXD2-AS1過表達導致的EphB3沉默被同時EZH2或LSD1敲除逆轉。這些結果表明FOXD2-AS1可以將EZH2和LSD1引入到EphB3啟動子中，抑制其轉錄。

圖5. FOXD2-AS1通過與EZH2、LSD1相互作用改變EphB3表達

5.促EphB3表達可抑制GC細胞增殖

數(shù)據(jù)顯示，相對于正常組織，GC組織中對EphB3的富集顯著降低，低的EphB3表達表明疾病進展。此外，將FOXD2-AS1與EphB3表達結合，可獲得較好的預后價值。使用IHC對106個匹配的GC及周圍正常組織的EphB3蛋白水平進行了評估，發(fā)現(xiàn)在約80%的非瘤性胃組織中，EphB3信號呈陽性，且這些腫瘤組織與周圍正常組織相比，大多表現(xiàn)出較低的EphB3蛋白表達。此外，EphB3蛋白表達水平越低，疾病階段越晚期。上述結果表明，低EphB3表達與GC進展有關。EphB3轉染實驗顯示EphB3與FOXD2-AS1誘導的GC細胞增殖有關。拯救實驗驗證了FOXD2-AS1通過阻斷EphB3表達來調控GC細胞生長。

圖6.促EphB3表達可抑制GC細胞增殖

總結：

云序生物&南京醫(yī)科大共同發(fā)表的這篇研究成果，為胃癌發(fā)生的機制提供了全新的認識。文章揭示FOXD2-AS1可能是胃癌關鍵的腫瘤促進基因，并有可能成為胃癌潛在的生物標志物和治療靶點�；仡櫲模瑥膶嶒炘O計、開展，再到數(shù)據(jù)的分析，每一個思路每一個方法都值得我們學習和借鑒，正確的選擇是成功的一半，這些都離不開云序生物強大的科研團隊所做出的貢獻。

全文信息：

Tong-peng Xu, et al. Upregulation of the long noncoding RNA FOXD2-AS1 promotes carcinogenesis by epigenetically silencing EphB3 through EZH2 and LSD1, and predicts poor prognosis in gastric cancer. Oncogene (2018), http://sci-hub.tw/10.1038/s41388-018-0308-y

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