一抗的選擇要點(diǎn)

1. 選擇單克隆還是多克隆抗體？由一種B細(xì)胞產(chǎn)生的單一特異性抗體叫做單克隆抗體，單克隆抗體能目標(biāo)明確地與單一特異抗原決定簇結(jié)合，就像導(dǎo)彈精確地命中目標(biāo)一樣。另一方面，即使是同一個(gè)抗原決定簇，在機(jī)體內(nèi)也可以由好幾種B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，形成抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應(yīng)中，一般單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對小、檢測抗原靈敏度相對較低；而多克隆抗體特異性稍弱、抗體的親和力強(qiáng)、靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色（實(shí)驗(yàn)時(shí)可以通過封閉等盡量避免非特異性染色）。

2. 抗體的種屬來源。一般兔來源的抗體多是多克隆；而小鼠來源的抗體多是單克隆，但也有例外�？贵w的來源這點(diǎn)非常重要，后面檢測時(shí)帶標(biāo)記的二抗必須與一抗來源相匹配。

3. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菣z測什么種屬的抗原，即Species Reactivity。這一點(diǎn)很重要，一般說明書上都有注明，如小鼠Mouse、大鼠Rat、人Human等等，選購時(shí)盡量選擇說明書上已經(jīng)標(biāo)注反應(yīng)性的抗體。

4. 能否做免疫組化？一般一抗說明書都會(huì)注明是否能做WB、IHC、ICC、IF等，建議最好選擇注明的抗體，因?yàn)橐话愣际墙?jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的。

5. 檢測標(biāo)本類型。用戶是檢測石蠟切片還是冰凍切片，一般能做石蠟切片的抗體，都可以用來檢測冰凍切片；但能做冰凍切片的抗體，不一定能檢測石蠟切片中的抗原。

6. 價(jià)格與質(zhì)量。進(jìn)口抗體時(shí)間長，且價(jià)格高，很多都是國內(nèi)廠家OEM的，科研型的抗體屬于濃縮型抗體，需要多摸索幾次實(shí)驗(yàn)條件，建立合適的實(shí)驗(yàn)條件后再進(jìn)行大批量的實(shí)驗(yàn)，并且實(shí)驗(yàn)操作者的熟練程度、對實(shí)驗(yàn)的把控等對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響也很大，實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)一定要把控好。另外，抗體切記避免反復(fù)凍融。 

二抗的選擇

1. 種屬來源。主要根據(jù)一抗種屬來源來決定購買二抗來源，如一抗是小鼠來源，那二抗就買抗小鼠的即可（二抗來源goat or Rabbit均可）；如一抗是兔來源，那二抗就買抗兔的即可。

2. 標(biāo)記物的選擇。常見的標(biāo)記物有HRP、Biotin、熒光素等。免疫組化現(xiàn)階段多用二步法，二步法使用的二抗通常是帶多聚HRP標(biāo)記的，普通的HRP標(biāo)記應(yīng)用到免疫組化效果會(huì)比較差；前幾年應(yīng)用比較多的三步法，二抗上帶Biotin標(biāo)記，然后加入HRP標(biāo)記的鏈霉素進(jìn)一步反應(yīng)。而免疫熒光染色就需要購買熒光素標(biāo)記的二抗，如羅丹明、FITC、Cy3等常用熒光素。如何選擇二抗主要看實(shí)驗(yàn)應(yīng)用是免疫組化還是免疫熒光。

3. 選擇IgM還是IgG。二抗需與一抗的類別或亞型相匹配，這通常是針對單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，因此相應(yīng)的二抗就是抗IgG抗體

    單克隆抗體的類別及亞型通常會(huì)在產(chǎn)品列表中列出，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相應(yīng)的二抗就應(yīng)當(dāng)是抗小鼠IgM，或是抗小鼠IgG抗體。如果單克隆一抗是小鼠IgG的某一亞型（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結(jié)合，或者你也可以選擇專門針對這一亞型的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以選擇抗IgG1的二抗，此種抗體在雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中尤其適合。如果你不知道一抗是哪一類別或亞型，那么抗小鼠IgG是一個(gè)不錯(cuò)的選擇，因?yàn)榇朔N抗體可以識(shí)別大多數(shù)類型的IgG免疫球蛋白。

     流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過程中，熒光抗體對單細(xì)胞懸液的標(biāo)記效果直接影響實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)質(zhì)量。因此選購流式抗體時(shí)需要綜合考慮各種影響抗體品質(zhì)及檢測效果的因素，例如抗體的特異性、熒光素信號(hào)的強(qiáng)弱、熒光素標(biāo)記的方式、同型對照等等。

如何選擇合適的流式抗體？

1.     流式抗體本身也是抗體，所以選擇流式抗體首先要滿足抗體選擇最基本的條件：目標(biāo)蛋白識(shí)別特異性、反應(yīng)種屬以及應(yīng)用實(shí)驗(yàn)；
2.     流式抗體熒光標(biāo)記的方式包括直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩種。在流式實(shí)驗(yàn)過程中，遵循盡量減少實(shí)驗(yàn)工序和過程以保證實(shí)驗(yàn)的真實(shí)性和準(zhǔn)確性，因此在條件允許的范圍內(nèi)，建議盡量用直接標(biāo)記的抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；
3.     流式抗體熒光標(biāo)記的選擇：不同熒光標(biāo)記在不同的儀器上強(qiáng)度不同，以FACS Calibur儀器為例：PE ＞APC ＞PE-Cy5 ＞PerCP＞FITC ＞PerCP-Cy5.5，通常來說，PE最強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原；FITC強(qiáng)度較弱，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原并且使用范圍比較廣泛。如果實(shí)驗(yàn)中檢測單一指標(biāo)，用戶可根據(jù)檢測的目標(biāo)蛋白表達(dá)豐度進(jìn)行選擇同時(shí)可兼顧標(biāo)記抗體的價(jià)格等綜合因素；如果同時(shí)檢測多個(gè)指標(biāo)，用戶先需要確認(rèn)流式細(xì)胞儀能檢測多少個(gè)通道-------流式抗體每個(gè)通道只能選擇1種熒光素，各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配，比如實(shí)驗(yàn)者同時(shí)檢測三個(gè)指標(biāo)，可以在下圖中綠色、黃色和紅色三個(gè)通道中各選一個(gè)適當(dāng)?shù)臒晒馑貥?biāo)記，例如FITC、PE和PE-Cy5。切忌所有指標(biāo)選擇同一個(gè)通道的熒光標(biāo)記，以防止熒光的重疊和相互干擾，影響最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，流式細(xì)胞儀的通道越多，同一份樣本可同時(shí)做的表面/胞內(nèi)標(biāo)志就越多。常用的熒光標(biāo)記包括FITC, PE, PE-Cy5, PE-Cy5.5, APC等。

同型對照的選擇

    流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和其他抗體相關(guān)實(shí)驗(yàn)有點(diǎn)不同的就是需要選擇同型對照。同型對照是用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色，相當(dāng)于實(shí)驗(yàn)的陰性對照。同型對照選擇與標(biāo)記抗體同種屬來源、同亞型、同熒光標(biāo)記的抗體。例如抗人的CD3的PE標(biāo)記的抗體，如果抗體來源于小鼠、亞型為IgG2a的話，就必須選擇PE標(biāo)記的小鼠的IgG2a作為同型對照。

流式抗體使用注意事項(xiàng)

1. 建議實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的數(shù)量和抗體的比例要適當(dāng)。細(xì)胞過量或抗體過量都可能影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此建議實(shí)驗(yàn)前先優(yōu)化一下試驗(yàn)條件。注：不同的流式技術(shù)對抗體的需求量有較大差異，例如傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù) （采用鞘液流系統(tǒng)）需要1×106個(gè)細(xì)胞為起始上樣量，抗體用量為10 μL，而微流式細(xì)胞術(shù)則只需5×105個(gè)細(xì)胞，抗體用量相應(yīng)的可減少到5 μL。
2. 帶熒光素標(biāo)記的流式抗體應(yīng)該4℃避光保存，不要冷凍。

相關(guān)參考

    流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）：是一種對液流中排成單列的細(xì)胞或其它生物微粒（如微球、細(xì)菌、小型模式生物等）逐個(gè)進(jìn)行快速定量分析和分選的技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)產(chǎn)生于上世紀(jì)六七十年代，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，是非常先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)。該技術(shù)被廣泛的應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)及臨床檢驗(yàn)等多個(gè)領(lǐng)域，如細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞活力的檢測、淋巴細(xì)胞亞群與疾病的關(guān)系研究、器官移植后的免疫學(xué)監(jiān)測、腫瘤的特異性指標(biāo)的檢測、藥物作用機(jī)制研究、篩選新藥等等。