一般我們把基因分成兩類：

• 編碼蛋白的基因
• 不編碼蛋白的基因

這兩類基因的敲除方式有著很大的區(qū)別

編碼蛋白的基因

這些基因的功能主要是通過編碼區(qū)中的三聯(lián)體密碼所編碼的蛋白來實(shí)現(xiàn)的�；�因敲除的最終目的是讓這個(gè)基因的蛋白產(chǎn)物不能發(fā)揮功能，或者蛋白不能表達(dá)。

• 整個(gè)編碼區(qū)統(tǒng)統(tǒng)刪掉

所有的密碼都沒了，當(dāng)然就不能翻譯出蛋白啦！對(duì)于目的基因的敲除來說，這當(dāng)然是最徹底的一種方法，不過大多數(shù)情況下，這個(gè)方案很難實(shí)現(xiàn)。原因有下面幾個(gè)：

1）編碼區(qū)跨度大。雖然CRISPR技術(shù)能夠大片段地剪掉DNA序列，實(shí)現(xiàn)大跨度的全身性基因敲除；但對(duì)于條件性基因敲除來說，如果兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間距離過大，仍會(huì)導(dǎo)致不僅構(gòu)建模型的難度大、重組率低下，而且可能影響flox小鼠的最終使用效果，即Cre-loxP的重組效率。

2）可能有其它基因存在于內(nèi)含子中，這樣的敲除相當(dāng)于敲除了兩個(gè)甚至多個(gè)基因，最終小鼠的表型就會(huì)是多個(gè)基因共同缺失的結(jié)果了。

• 僅僅刪掉“一小部分”

1）刪掉一個(gè)或幾個(gè)外顯子，被刪掉的外顯子長(zhǎng)度不是3的整數(shù)倍。這樣的話，三聯(lián)體密碼就會(huì)發(fā)生錯(cuò)位，導(dǎo)致移碼突變或提前終止�？赡軙�(huì)使蛋白不能被翻譯出來，也可能會(huì)產(chǎn)生一個(gè)突變的蛋白產(chǎn)物。這也是最為常見的基因敲除策略。通常，刪掉的外顯子越靠前，對(duì)功能蛋白的破壞就越徹底。所以，盡量要選擇靠前的外顯子作為基因的敲除區(qū)域。

2）刪掉編碼功能結(jié)構(gòu)域的部分。這樣，即使沒能發(fā)生移碼，最終翻譯出來的也會(huì)是缺失功能域的一個(gè)次品，也可以達(dá)到使蛋白功能缺失的目的。

3）刪掉啟動(dòng)子。如果1和2都不能作為敲除區(qū)域的話，可以考慮敲除啟動(dòng)子區(qū)域使基因失活。

所以，基因敲除并不是非要把整個(gè)基因都刪掉，大多數(shù)情況我們只需要敲掉基因的一小部分，讓這個(gè)基因不能編碼正常的功能蛋白，也就達(dá)到了基因敲除的目的。

不編碼蛋白的基因

對(duì)于要敲除像lncRNA、microRNA這些不編碼蛋白的基因，最徹底的方法還是整個(gè)lncRNA區(qū)段或大部分片段序列的刪除。

但是，很多l(xiāng)ncRNA可能是與某個(gè)蛋白編碼基因反向重疊或部分反向重疊的，這時(shí)候敲掉整個(gè)lncRNA序列就不合適了，可以考慮以下幾種方式：

1）刪除一小部分功能區(qū)域，前提是已知這部分可能是特定的功能區(qū)。

2）刪除啟動(dòng)子區(qū)域，如果lncRNA啟動(dòng)子區(qū)域不跟其它基因重疊。

3）通過CRISPR技術(shù)插入RNA不穩(wěn)定信號(hào)（比如polyA信號(hào)、miRNA結(jié)合位點(diǎn)、RNase P識(shí)別位點(diǎn)、自剪切酶等）的方式，來進(jìn)行l(wèi)ncRNA的敲低。

所以，針對(duì)這些不編碼蛋白的基因，考慮本身結(jié)構(gòu)的特殊性，需要我們面對(duì)不同基因時(shí)選擇不同的敲除方式。