如今，流式細胞術已經成為一項功能強大的技術，可在數秒內對數千個單個細胞或其他顆粒的多項參數進行分析。在流式細胞分析中，熒光素受到一定波長的激光激發(fā)后，釋放出的能量能發(fā)射出一定波長的熒光，因此我們在選擇熒光素時應注意它們的激發(fā)波長和發(fā)射波長，以選擇正確的激光器和熒光組合。隨著多色流式細胞儀的出現，新熒光素和標記抗體也得到了長足發(fā)展。然而為實驗中所需抗體選擇最佳的熒光染料組合是一個復雜的過程。Elabscience的技術團隊總結了一些常用流式熒光素和多色流式細胞中熒光素的選擇原則，幫助您避免重復實驗和錯誤，增加實驗的成功率：

1. 常用熒光素的種類特性及檢測濾片

面對種類繁多的熒光染料，如何知道這些染料是否適合您所擁有的流式細胞儀，以及這些染料間的顏色補償究竟有多大呢？

注釋：

a. 以eFluorTM450為例:最大激發(fā)波長為405 nm或407 nm,最大發(fā)射波長為450 nm（最大激發(fā)波長取決于流式細胞儀激光器的激發(fā)光），需440/40 (即檢測波長范圍為440±20 nm)或450/50 (即檢測波長范圍為440±25 nm)的帶通濾片(BP, Band Pass)。  

b. 以eFluorTM605NC為例:最大激發(fā)波長為335 nm, 405 nm或407 nm,最大發(fā)射波長為605 nm ，流式細胞儀檢測時需605/40 (即檢測波長范圍為605± 20 nm)的帶通濾片。

注釋：

a. 表中數值表示各熒光檢測通道間的顏色補償值(compensation),單位為%。  

b. 以FITC和PE為例：若流式細胞儀的FL1通道檢測FITC, FL2通道檢測PE,則需將儀器的補償設置為FL1-%FL2=1.10，FL2-%FL1=16.52.具體可理解為PE熒光素的1.10%漏到FL1檢測通道,需從FL1中減除，而FITC熒光素的16.52%漏到FL2檢測通道，需從FL2中減除。

2. 常見熒光素熒光強度比較

熒光的強度與染色指數(Stain Index)有關，染色指數越高，熒光強度越好；染色指數較低，染色強度相對較差。

通過染色指數可以看出各個熒光素的強度：PE>APC>FITC>PerCP

3. 多色流式細胞檢測中熒光素選擇的原則

1) 根據機器配置選擇熒光素

了解你使用的流式細胞儀的性能，大多數流式細胞儀有兩個或者多個激光器，有五種波長可供選擇：紫外（355 nm）、紫色（405 nm）、藍色（488 nm）、黃色（561 nm）和紅色（640 nm）。除了激光器，具體的激光片和檢測器也決定了你的配置可同時檢測多少種顏色。

多色標記熒光素搭配原則：每個通道只能選擇一種熒光素；各個通道之間的熒光素可以隨意搭配。常用的四色搭配為：FITC, PE, PerCP, APC。

2) 盡量選擇熒光度強的熒光素

FITC、PE、PC-CY5和APC是目前流式細胞檢測常用熒光素，基本能滿足日常臨床和科研的需要，盡量選擇熒光強的熒光素。細胞表面或者內部的各種抗原表達量也不同，如CD4和CD8在細胞表面的表達分子數很多，而CD25等分子在細胞上的表達量則不多，在用流式細胞術分析這些分子時應根據表達量選擇熒光素，對于表達量較多的分子，可用FITC等弱熒光素，而對于表達量較少的分子，則須針對您特異的儀器配置，選用熒光較強的熒光素，如PE, PE-CY5或PE-CY5.5等。

3) 保證搭配熒光素的質檢發(fā)射光譜重疊度盡量小

當兩種熒光基團的發(fā)射光譜重疊時，可能會觀察到一種熒光基團滲漏到另一種的檢測通道（如FITC和PE）。如果不適用熒光補償技術，就很難分辨不同的群體。最好選擇很少的或者沒有重疊的熒光基團，以最大限度減少這種滲漏。選擇試劑組合時將光譜疊加可能性降到最低，這可能與選擇最亮的熒光素的規(guī)則是沖突的，如在進行四色分析，經常會將PE-Cy5標記的抗體與APC標記的抗體搭配使用，此搭配需較大幅度地調節(jié)兩者的顏色補償。可選用PE-Cy5.5來替代PE-Cy5，顏色補償只需1%左右。因為Cy5的激發(fā)波長與APC的激發(fā)波長相近，所以PE-Cy5熒光素中的Cy5，也會被激發(fā)APC的第二個激光器（氦氖激光器）所激發(fā)，導致PE-Cy5與APC的顏色補償很難調。相反，PE-Cy5.5中的Cy5.5激發(fā)波長為675nm，不能被激發(fā)APC的第二個激光器所激發(fā)，也就不存在Cy5.5對APC的干擾，顏色補償也就很小。因此，可能需要犧牲個別熒光素的亮度來避免熒光滲漏以及敏感度喪失。

 要通過單標對照進行補償調節(jié)：

所以盡量選擇光譜重疊度小的熒光素，如FITC/PE-Cy7； 選擇不同激光激發(fā)的熒光素，如FITC/APC, PE/APC。

4) 盡量避免偶聯熒光染料使用帶來的假陽性

隨著顏色的數量不斷增加，實驗中可能會用到偶聯熒光染料。偶聯熒光染料是指兩種熒光素聯接在一起進行熒光共振能量轉移，如PE-Alexa-Fluor 647或APC-Cy7。但偶聯熒光染料很容易降解，導致解偶聯以及兩個波長下的熒光發(fā)射，從而出現假陽性，若使用偶聯的熒光素，務必要在短時間內盡快完成實驗，曝光時間越長，熒光素就越不穩(wěn)定。在固定和透化的過程中，偶聯熒光染料的亮度可能降低，因此操作步驟應當盡可能溫和。補償值可通過以相同方式處理的樣品來獲得。