免疫印跡實驗相關(guān)原理介紹
免疫印跡(Western blot)簡介和原理
免疫印跡用于鑒定能夠與特異性抗體相互作用的大分子抗原（一般為蛋白質(zhì)）并測定抗原的大小。蛋白質(zhì)首先通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再通過電泳轉(zhuǎn)移到固相支持物上，固相支持物包括硝酸纖維素膜，聚偏乙烯二氟（PVDF）膜和陽離子尼龍膜等。首先把膜上未反應(yīng)的位點封閉起來以抑制抗體的非特異性吸附，這樣固定的蛋白即可與特異性的多克隆或單克隆抗體相互作用。最后通過放射，生色或化學(xué)發(fā)光的方法進行定位。
實驗常規(guī)試劑
1. 1.0 mol/L Tris•HCl （pH6.8）
2. 1.5 mol/L Tris•HCl（pH8.8）
3. 10% SDS
4. 10% 過硫酸胺（AP）
7. 還原型 5XSDS 上樣緩沖液
8. 10X電泳液緩沖液
9. 10X轉(zhuǎn)膜緩沖液
10. 1X轉(zhuǎn)膜緩沖液
11. 10XTBS緩沖液
12. 1XTBST緩沖液
13. 封閉緩沖液: 1X TBST 含5% w/v 脫脂牛奶或者1X TBST 含2%-5%的牛血清白蛋白(BSA)。
14. 一抗/二抗稀釋緩沖液: 常規(guī)稀釋液使用的是含5% BSA 或5%脫脂牛奶的1X TBST，見一抗/二抗說明書；每種Elabscience®抗體都有固定的最佳稀釋比例。
操作步驟
1. 根據(jù)待測蛋白分子量大小確定凝膠（分離膠）濃度制膠
2. 上樣 使用適當(dāng)?shù)牧呀庖阂约傲呀夥椒呀赓N壁細胞、懸浮細胞或者組織樣品。
3. 跑膠： 濃縮膠推薦用 80 伏電壓，待樣品進入分離膠后，可用 120-180 伏。
4. 跑膠完成以后，需先將膠上無樣品的多余部分切除，濾紙和海綿需要預(yù)先潤濕。
5. 分離的多肽轉(zhuǎn)移至膜載體上
選擇合適的膜
轉(zhuǎn)膜：以NC膜為例
提前十分鐘到半小時用轉(zhuǎn)膜 Buffer 潤洗 NC 膜
按照以下的結(jié)構(gòu)來安裝轉(zhuǎn)膜體系：負極-海綿-三層濾紙-膠-膜-兩層濾紙-海綿-負極。
6. 轉(zhuǎn)膜，一般為 2 小時。
7. 轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5 min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。 將膜晾干備用。
8. 抗原檢測
免疫印跡膜上非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合位點的封閉：
a. 轉(zhuǎn)好的膜先用 TBST 潤洗兩次，每次五分鐘。低速水平搖床，常溫。
b. 用 5%的脫脂牛奶（TBST 配制）常溫封閉一至兩小時。封閉過程應(yīng)在常溫下置于轉(zhuǎn)速較低的水平搖床。
抗體與抗原特異性結(jié)合：一抗孵育
9-11.用 TBST 洗膜三次，每次十分鐘。
12. 常溫下用二抗孵育一到兩個小時。
13-15. 用 TBST 洗膜三次，每次十分鐘。
16. 準備 ECL 底物，對 8×5 cm 的膜，2毫升（1 毫升 A 加1 毫升 B）足夠。將膜浸潤底物中 1 分鐘，然后取出，用濾紙吸掉膜上多余的底物。
17. 用 x-ray 底片曝光，根據(jù)信號的強弱適當(dāng)調(diào)整曝光時間，一般為1 min或5 min，也可選擇不同時間多次壓片，以達最佳效果；曝光完成后，打開X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。
Western blot常見問題分析指南
為什么電泳的條帶很粗？
電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。
處理辦法：適當(dāng)增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確(6.7）；適當(dāng)降低電壓；
為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？
這種現(xiàn)象一般初學(xué)者易出現(xiàn)。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內(nèi)外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。
處理辦法：電泳槽正確裝配即可。
