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                                細(xì)菌基因組DNA提取試劑使用說明書

                                瀏覽次數(shù):13150 發(fā)布日期:2018-6-16  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)

                                細(xì)菌基因組DNA提取試劑使用說明書

                                ◆ 產(chǎn)品說明

                                基于硅膠柱純化方式。試劑中的溶菌酶消化去除細(xì)菌的細(xì)胞壁,革蘭氏陽性細(xì)菌還可加入玻璃珠渦旋破壁,在裂解液和蛋白酶作用下裂解消化,DNA釋放到裂解液中。加入乙醇后,轉(zhuǎn)移至吸附柱中過濾,DNA被吸附至吸附柱的膜上,而蛋白質(zhì)則被去除。吸附柱經(jīng)Buffer GW2洗滌后去除其他雜質(zhì),最后通過低鹽緩沖液(Buffer AE等)洗脫DNA,洗脫的DNA可直接用于恒溫?zé)晒夥ê蜔晒舛縋CR檢測(cè)等。

                                ◆ 產(chǎn)品組成

                                071021M

                                成份

                                含量

                                吸附柱

                                48個(gè)

                                2ml收集管

                                48個(gè)

                                 Buffer  STE

                                30 ml

                                 Buffer  SDS

                                2 ml

                                Buffer  DL

                                30 ml

                                  Buffer  GW2

                                20 ml

                                Buffer  AE

                                6 ml

                                Lysozyme

                                100 mg

                                 Proteinase K

                                24 mg

                                Protease Dissolve Buffer

                                2 ml

                                說明書

                                1份

                                 
                                • 儲(chǔ)存條件及有效期

                                Proteinase K干粉和Lysozyme為干粉狀,常溫運(yùn)輸,保存于2 - 8℃或-20℃,其他組分可在室溫下保存,保質(zhì)期為一年。低溫狀態(tài)下,Buffer SDS或有微量沉淀形成,需37℃下使其溶解。

                                • 自備材料
                                • 無水乙醇(≥96%);
                                • 離心管和吸頭;
                                • 離心機(jī);
                                • 水浴鍋或金屬浴

                                ◆ 試劑配制

                                1)添加0.6ml Protease Dissolve Buffer至Proteinase K干粉中,顛倒混勻使蛋白酶K充分溶解,于-20℃保存。

                                2)添加2ml Protease Dissolve Buffer至Lysozyme管子中,顛倒混勻使溶菌酶充分溶解,于-20℃保存。

                                3)添加40 ml無水乙醇稀釋Buffer GW2,于室溫下保存。

                                ◆ 使用方法

                                一. 革蘭氏陰性細(xì)菌DNA提取

                                 該方案適合于從﹤1.5 × 109個(gè)革蘭氏陰性細(xì)菌中提取總DNA。細(xì)菌數(shù)量可以通過分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。1OD600約為1.5 × 109個(gè)革蘭氏陰性細(xì)菌。

                                • 轉(zhuǎn)移0.5-1ml細(xì)菌培養(yǎng)液(<1.5 × 109個(gè)細(xì)菌)至1.5ml離心管中。10,000rpm離心1分鐘收集細(xì)菌,倒棄培養(yǎng)液。
                                • 加入200µl Buffer STE、10µl Lysozyme和10µl Proteinase K至細(xì)菌沉淀團(tuán)中。渦旋充分重懸細(xì)菌,37℃水浴10~30分鐘。
                                • 加入220µl Buffer DL至細(xì)菌重懸液中。渦旋混勻,65℃水浴消化30分鐘。
                                • 加入220µl無水乙醇至裂解液中。最高速度渦旋30秒。

                                注:這一步若有絮狀沉淀出現(xiàn),用移液槍吸打幾次盡量打散沉淀。

                                • 把吸附柱Column裝在2ml收集管中。把第4步獲得的混合液(包括沉淀)轉(zhuǎn)移至吸附柱中。10,000rpm離心1分鐘。

                                注:若吸附柱出現(xiàn)堵塞,提高離心速度至13,000 rpm,離心3分鐘。

                                • 倒棄濾液,把吸附柱裝回收集管中。加入600µl Buffer GW2(已用乙醇稀釋)至吸附柱中。10,000rpm離心1分鐘。

                                注:Buffer GW2須用無水乙醇稀釋,按瓶子標(biāo)簽或說明書指示進(jìn)行稀釋。

                                • 倒棄濾液,把吸附柱裝回收集管中。再加入300µl Buffer GW2(已用乙醇稀釋)至吸附柱中。10,000rpm離心3分鐘。
                                • 將吸附柱裝在新的1.5ml離心管中。加入30-50µl預(yù)熱至65℃ Buffer AE至吸附柱膜中央。放置3分鐘。10,000rpm離心1分鐘。

                                9.  丟棄DNA結(jié)合柱,DNA保存于2-8℃,長期保存需保存于-20℃。

                                二. 革蘭氏陽性細(xì)菌DNA提取

                                 該方案適合于從﹤1.5 × 109革蘭氏陽性細(xì)菌中提取總DNA。細(xì)菌數(shù)量可以通過分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。1OD600約為1.5 × 109個(gè)革蘭氏陽性細(xì)菌。革蘭氏陽性細(xì)胞的細(xì)胞壁很厚,不能直接進(jìn)行裂解。需通過溶菌酶消化去除細(xì)胞壁。革蘭氏陰性細(xì)菌和大部分的革蘭氏陽性細(xì)菌如桿菌,通過酶法處理就可達(dá)到良好的破壁效果。某些革蘭氏陽性細(xì)菌因帶有很厚的細(xì)菌壁,還需結(jié)合珠磨法才能達(dá)到效果。

                                • 酶法:采用溶菌酶(Lysozyme)消化細(xì)胞壁,把細(xì)菌轉(zhuǎn)化為原生質(zhì)體。葡萄珠菌屬包有較厚的細(xì)胞壁,還需結(jié)合溶葡萄球菌素(Lysostaphin)一起消化。
                                • 珠磨聯(lián)酶法:先采用溶菌酶消化細(xì)胞壁,然后采用酸洗玻璃珠(0.1-0.2mm)高速渦旋振蕩使細(xì)菌發(fā)生裂解。處理葡萄球菌,糞膿球菌等裂解細(xì)菌時(shí),加入玻璃珠渦旋能明顯提高產(chǎn)量。
                                • 轉(zhuǎn)移0.5-1ml細(xì)菌培養(yǎng)液(﹤1.5 × 109個(gè)細(xì)菌)至1.5ml離心管中。10,000rpm離心1分鐘收集細(xì)菌,倒棄培養(yǎng)液。

                                注:若培養(yǎng)液密度比較大,離心速度和離心時(shí)間都可能需要提高,以保證細(xì)菌的充分沉淀收集。若需要從菌斑中提取DNA:用接種環(huán)刮下菌斑,按第2步進(jìn)行操作,把菌斑轉(zhuǎn)移至Buffer STE,渦旋混勻。

                                • 加入200µl Buffer STE和30µl Lysozyme至細(xì)菌沉淀團(tuán)中。渦旋充分重懸細(xì)菌,37℃水浴30分鐘。處理葡萄球菌屬的細(xì)菌時(shí),最好再加入1µl Lysostaphin(20mg/ml)。
                                • 加入15µl Buffer SDS和10µl Proteinase K至細(xì)菌重懸液中。渦旋混勻,65℃水浴消化30分鐘。
                                • 室溫下,10,000rpm離心3分鐘。轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中。
                                • 加入250µl Buffer DL和250µl無水乙醇至裂解液中。最高速度渦旋30秒。

                                注:這一步若有明顯的絮狀沉淀,用移液槍吸打幾次盡量打散沉淀。

                                • 把吸附柱Column裝在2ml收集管中。轉(zhuǎn)移第5步獲得的混合液(包括沉淀)至吸附柱中。10,000rpm離心1分鐘。

                                注:若吸附柱出現(xiàn)堵塞,提高離心速度至13,000 rpm,離心3分鐘。

                                • 倒棄濾液,把吸附柱裝回收集管中。加入600 µl Buffer GW2(已用乙醇稀釋)至吸附柱中。10,000rpm離心1分鐘。

                                注:Buffer GW2須用無水乙醇稀釋,按瓶子標(biāo)簽或說明書指示進(jìn)行稀釋。

                                • 倒棄濾液,把吸附柱裝回收集管中。再加入300µl Buffer GW2(已用乙醇稀釋)至吸附柱中。10,000rpm離心2分鐘。
                                • 將吸附柱裝在新的1.5ml離心管中。加入30-50µl預(yù)熱至65ºC Buffer AE至吸附柱膜中央。放置3分鐘。10,000rpm離心1分鐘。
                                • 丟棄DNA結(jié)合柱,DNA保存于2-8℃,長期保存需保存于-20℃。

                                三.組織或液體樣品中細(xì)菌DNA提取

                                該方案適合于從各種組織、血液、分泌液等液體樣品中提取基因組DNA和寄生的細(xì)菌DNA。純化的DNA可直接用于各種細(xì)菌的檢測(cè)。若需從糞便樣品中提取細(xì)菌DNA,我們推薦使用DePure Stool DNA Kit,若需要從土壤樣品中提取細(xì)菌DNA,推薦使用DePure Soil DNA Kit。

                                • 按以下方案進(jìn)行預(yù)處理:
                                • 固體樣品:將10mg固體樣品剪切成小碎片,并轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中,加入200µl Buffer STE和10µl Buffer SDS。
                                • 全血樣品:取<1ml抗凝血液按常規(guī)流程分離得到細(xì)胞和細(xì)菌。加入200µl Buffer STE和10µl Buffer SDS,用移液槍吸打重懸細(xì)胞。
                                • 分泌物或血清等: 10,000 × g離心3分鐘收集細(xì)胞和細(xì)菌;倒棄上清液,加入200µl Buffer STE和10µl Buffer SDS,用移液槍吸打重懸細(xì)胞。
                                • 粘稠的分泌液:取100µl或100mg 痰液等,加入100µl Buffer STE,10µl Buffer SDS和5 µl 1M 二硫蘇糖醇DTT。(若需要從痰液中分離結(jié)核桿菌或真菌,可先用NaOH進(jìn)行痰液液化,離心收集得到沉淀后再進(jìn)行操作。)
                                • 加入10µl Proteinase K至重懸液中。渦旋混勻。55℃水浴1-3小時(shí)或直至樣品完全消化。按細(xì)菌和細(xì)胞總DNA的提取流程,或難裂解細(xì)菌提取流程進(jìn)行操作。

                                細(xì)菌和細(xì)胞總DNA提取 

                                • (可選) 95℃水浴10分鐘進(jìn)一步裂解細(xì)菌。
                                • 10,000rpm離心3分鐘。轉(zhuǎn)移上清液至新的1.5ml離心管中。
                                • 加入200µl Buffer DL和200µl無水乙醇至上清液中。渦旋20秒。
                                • 按第7-12步進(jìn)行操作。

                                難裂解細(xì)菌DNA提取

                                • 10,000rpm離心3分鐘收集未消化的細(xì)菌。吸棄所有的上清液。
                                • 加入200µl Buffer STE和30µl Lysozyme至細(xì)菌沉淀團(tuán)中。渦旋充分重懸細(xì)菌,37℃水浴30-60分鐘。處理葡萄球菌屬的細(xì)菌時(shí),最好再加入1µl Lysostaphin(20mg/ml)。
                                • 加入20µl Buffer SDS至細(xì)菌重懸液中。渦旋混勻,95℃水浴10分鐘。
                                • 加入250µl Buffer DL和250µl無水乙醇至裂解液中。最高速度渦旋30秒。按第7-12步進(jìn)行操作。

                                過柱吸附DNA

                                • 把吸附柱Column裝在2ml收集管中。轉(zhuǎn)移上一步獲得的混合液(包括沉淀)至吸附柱中。10,000rpm離心1分鐘。

                                注:若吸附柱出現(xiàn)堵塞,提高離心速度至13,000rpm,離心3分鐘。

                                • 倒棄濾液,把吸附柱重新裝回收集管中。加入650 µl Buffer GW2(已用乙醇稀釋)至吸附柱中。10,000rpm離心1分鐘。

                                注:Buffer GW2須用無水乙醇稀釋。按瓶子標(biāo)簽或說明書指示進(jìn)行稀釋。

                                • 倒棄濾液,把吸附柱重新裝回收集管中。再加入300 µl Buffer GW2(已用乙醇稀釋)至吸附柱中。10,000rpm離心2分鐘。
                                • 將吸附柱裝在新的1.5ml離心管中。加入30-100µl預(yù)熱至65℃ Buffer AE至吸附柱膜中央。放置3分鐘。10,000rpm離心1分鐘。
                                • 再加入30-100µl預(yù)熱至65℃ Buffer AE至吸附柱的膜中央。放置3分鐘。10,000rpm離心1分鐘。

                                12.  丟棄DNA結(jié)合柱,DNA保存于2-8℃,長期保存需保存于-20℃。

                                四.拭子樣品中細(xì)菌總DNA提取

                                該方案適合于從各種拭子樣品中提取基因組DNA和總細(xì)菌DNA。

                                • 轉(zhuǎn)移拭子樣品至2ml離心管中。加入350µl Buffer STE和30µl Lysozyme至拭子樣品中。渦旋充分重懸細(xì)菌,37℃水浴10-30分鐘。處理葡萄球菌屬的細(xì)菌時(shí),最好再加入1µl Lysostaphin(20mg/ml)。
                                • 加入30µl Buffer SDS和10µl Proteinase K至細(xì)菌重懸液中。渦旋混勻,65℃水浴消化30分鐘。
                                • (可選)95℃水浴10分鐘進(jìn)一步裂解難裂解的細(xì)菌。
                                • 加入400µl Buffer DL和400µl無水乙醇至裂解液中。渦旋20秒。
                                • 把DNA柱裝在收集管中。轉(zhuǎn)移600µl混合液(第4步獲得的混合液)至吸附柱中。10,000rpm離心1分鐘。
                                • 倒棄流出液,把吸附柱裝回收集管中。把剩余的混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱中。10,000rpm離心1分鐘。
                                • 倒棄濾液,把吸附柱重新裝回收集管中。加入650 µl Buffer GW2(已用乙醇稀釋)至吸附柱中。10,000rpm離心1分鐘。

                                注:Buffer GW2須用無水乙醇稀釋。按瓶子標(biāo)簽或說明書指示進(jìn)行稀釋。

                                • 倒棄濾液,把吸附柱重新裝回收集管中。再加入300 µl Buffer GW2(已用乙醇稀釋)至吸附柱中。10,000rpm離心2分鐘。

                                9.   將吸附柱裝在新的1.5ml離心管中。加入30-50µl預(yù)熱至65℃ Buffer AE至吸附柱膜中央。放置3分鐘。10,000rpm離心1分鐘。丟棄DNA結(jié)合柱,DNA保存于2-8℃,長期保存需保存于-20℃。

                                注意事項(xiàng)

                                1.實(shí)驗(yàn)過程中穿戴工作服、乳膠手套和口罩,使用移液器,試驗(yàn)產(chǎn)生的所有廢棄物及時(shí)處理。

                                2.請(qǐng)嚴(yán)格按照操作步驟操作,如有技術(shù)問題,請(qǐng)及時(shí)與我們聯(lián)系。

                                3.請(qǐng)?jiān)谟行趦?nèi)使用試劑盒。

                                來源:上海一基實(shí)業(yè)有限公司
                                聯(lián)系電話:021-60536261
                                E-mail:2851717098@qq.com

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