前言

基于細(xì)胞的化合物篩選模型已變的越來越復(fù)雜，以展示生物系統(tǒng)的復(fù)雜性�；罴�(xì)胞成像和三維模型為活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞過程提供了有價(jià)值的見解。最近在開發(fā)代表人類不同種類組織的復(fù)雜類器官模型方面有了很大的進(jìn)展，其中包括肝臟、胰腺、神經(jīng)和心肌組織。心肌細(xì)胞球能夠在體外環(huán)境下收縮并且可對(duì)不同調(diào)控因子的影響作出反應(yīng)。這里，我們將介紹一種包括成像和分析的實(shí)驗(yàn)方法，此方法可用于監(jiān)測(cè)體外心肌細(xì)胞球的跳動(dòng)及其跳動(dòng)模式特征。

在研究心肌細(xì)胞毒性的案例中，實(shí)時(shí)觀察到心肌細(xì)胞的跳動(dòng)行為將使科學(xué)家們通過使用透射光、相差和熒光成像方式從單一實(shí)驗(yàn)中獲得多參數(shù)結(jié)果。在藥物研發(fā)的早期階段篩選化合物毒性，能夠大大節(jié)約后期藥物對(duì)心血管副作用導(dǎo)致藥物研發(fā)失敗所產(chǎn)生的成本。

這促使了開發(fā)生物相關(guān)的、高通量、高內(nèi)涵篩選工具如心肌細(xì)胞球。

高內(nèi)涵篩選產(chǎn)生出大量需要快速和自動(dòng)化分析的數(shù)據(jù)。SoftMax® Pro 軟件的數(shù)據(jù)導(dǎo)入功能可以讓您分析任何科學(xué)數(shù)據(jù)，包括高內(nèi)涵成像系統(tǒng) ( 圖1 ) 的數(shù)據(jù)。通過將基于圖像的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)導(dǎo)入 SoftMax Pro 軟件中，我們能夠詮釋和定量一系列心肌毒性化合物處理后的心肌細(xì)胞球跳動(dòng)模式。

優(yōu)勢(shì)

- 分析數(shù)據(jù)來自實(shí)驗(yàn)圖像
- 利用 SoftMax Pro Peak Pro 分析算法快速量化心肌細(xì)胞跳動(dòng)模式
- 使用同一個(gè)軟件系統(tǒng)即可對(duì)導(dǎo)入的其他任何科研儀器獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析

材料和方法

大鼠心肌微組織球 (InSphero AG, Switzerland) 培養(yǎng)于 96 孔 GravityTRAP^TM (InSphero AG) 檢測(cè)板中。先用鈣離子染料 (EarlyTox® Cardiotoxicity Kit，#R8210，Molecular Devices) 處理細(xì)胞球 2 小時(shí)，再加入DMSO、0.1 μM 異丙 ( 去甲 ) 腎上腺素、0.1 μM 心得安、1 μM 異搏定、1 μM 西沙必利或 1 μM 利多卡因處理 30 分鐘。處理后的細(xì)胞球在 ImageXpress® MicroXLS 系統(tǒng)下以 10x 放大倍數(shù)成像，使用 timeLapse 模式每秒拍攝 10 次，共300個(gè)時(shí)間點(diǎn)，此成像系統(tǒng)是一款全自動(dòng)寬場(chǎng)(1x-100x) 顯微鏡，能夠?qū)�固定或活�?xì)胞、組織和小型器官進(jìn)行熒光、透射光和相差成像。

Time-lapse 圖像通過 MetaXpress® 高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件對(duì)熒光強(qiáng)度 (FI) 進(jìn)行測(cè)定并定量。動(dòng)態(tài) FI 數(shù)據(jù)導(dǎo)出到 Microsoft Excel， 整理成基于 Excel 的導(dǎo)入模板，然后再導(dǎo)入到 SoftMax Pro v6.4.2 中。利用預(yù)設(shè)的心肌細(xì)胞跳動(dòng) i3 ( 高級(jí) ) 模板分析數(shù)據(jù)，此模板可在 中下載，自動(dòng)計(jì)算出 14 個(gè)峰的特點(diǎn)：峰計(jì)數(shù)、峰頻率、峰的振幅、平均峰寬度和標(biāo)準(zhǔn)偏差、平均峰值上升時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)偏差、平均峰值衰減時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)偏差、平均峰間距和標(biāo)準(zhǔn)偏差、平均峰底寬度和標(biāo)準(zhǔn)偏差以及峰的規(guī)律。

結(jié)果

在這一研究中，取自 InSphero 的大鼠心肌微組織的跳動(dòng)細(xì)胞球用一系列心肌毒性化合物處理并由 EarlyTox Cardiotoxicity 試劑盒測(cè)定，此試劑盒包含鈣離子敏感染料用以檢測(cè)與心肌細(xì)胞收縮有關(guān)的細(xì)胞質(zhì)鈣濃 度 變 化 。 處理后的心肌細(xì)胞球Time-lapse 圖像通過 ImageXpress MicroXLS 采集以觀察其跳動(dòng)行為 ( 圖2 )。熒光強(qiáng)度波動(dòng)結(jié)果通過基于 Excel 的導(dǎo)入功能模板導(dǎo)入到 SoftMax Pro v6.4.2 中用以定量峰參數(shù)和化合物對(duì)心肌跳動(dòng)的影響 ( 圖3a )。與對(duì)照相比，異丙 ( 去甲 ) 腎上腺素處理的心肌細(xì)胞球跳動(dòng)頻率增加而心得安、西沙比利和利多卡因處理的心肌細(xì)胞球則降低。另外，在降低頻率的化合物中，西沙比利可以打亂心肌細(xì)胞球的跳動(dòng)模式。

維拉帕米，一種鈣離子通道阻滯藥，用它處理心肌細(xì)胞球，可抑制鈣信號(hào) ( 圖 3b 和4 )。綜上所述，這些結(jié)果是與之前的研究完全一致的^5,6。

結(jié)論

使用生物學(xué)相關(guān)的、基于細(xì)胞的模型進(jìn)行高內(nèi)涵和高通量心肌毒性篩選測(cè)定可以大大減少藥物研發(fā)早期對(duì)心肌毒性藥物發(fā)現(xiàn)的時(shí)間。為了保持高通量和高內(nèi)涵篩選測(cè)定的效率，就需要同樣快速的數(shù)據(jù)分析。SoftMax Pro 的導(dǎo)入功能可用于 SoftMaxPro v6.4.1 或更高版本，能夠分析從包括成像系統(tǒng)、實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng)、非 Molecular Devices 公司的讀板機(jī)、閃爍計(jì)數(shù)器等多種科研儀器采集到的微孔板格式數(shù)據(jù)�；�于 Excel 和基于 XML 的兩種導(dǎo)入選擇，提供了一系列自動(dòng)化功能，從手動(dòng)導(dǎo)入到全自動(dòng)數(shù)據(jù)導(dǎo)入和分析。另外，Peak Pro 軟件算法和預(yù)設(shè)模板可以專門用于對(duì)多個(gè)峰的波動(dòng)數(shù)據(jù)如心肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞球跳動(dòng)進(jìn)行定量，SoftMax Pro 的方程系統(tǒng)和 Syntax Helper 可以幫助獲得您需要的結(jié)果包括 IC₅₀ 曲線和條件通過 /失敗的結(jié)果。自定義的模板可以重復(fù)使用，確保無論數(shù)據(jù)來源如何都能進(jìn)行有效和一致的分析。

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