細(xì)胞周期指細(xì)胞一個世代所經(jīng)歷的時間。從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個周期。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。細(xì)胞周期是一個重要的檢測參數(shù)，研究細(xì)胞周期變化的影響對于腫瘤的發(fā)展及藥物研發(fā)有著重要的作用。例如，已知抑制有絲分裂的化合物大都用來減緩腫瘤細(xì)胞的生長。

細(xì)胞周期內(nèi)有兩個階段最為重要：G1 到 S 和 G2 到 M；這兩個階段正處在復(fù)雜活躍的分子水平變化的時期，容易受環(huán)境條件的影響，如果能夠人為地進(jìn)行調(diào)控，將對深入了解生物的生長發(fā)育和控制腫瘤生長等有重要意義。能夠方便有效地檢測細(xì)胞周期的變化，對于藥物研發(fā)和疾病研究等都具有重要的意義。

單個細(xì)胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細(xì)胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測群體周期。

那么，細(xì)胞周期的測定如何進(jìn)行的呢？測定細(xì)胞周期的方法很多，有同位素標(biāo)記法、流式細(xì)胞儀法、基于細(xì)胞成像的熒光檢測法等。

一、同位素標(biāo)記法測定細(xì)胞周期

標(biāo)記有絲分裂百分率法 (PLM) 是一種常用的測定細(xì)胞周期時間的方法。其原理是對測定細(xì)胞進(jìn)行脈沖標(biāo)記、定時取材、利用放射自顯影技術(shù)顯示標(biāo)記細(xì)胞，通過統(tǒng)計標(biāo)記有絲分裂細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的辦法來測定細(xì)胞周期。

測定原理：

① 待測細(xì)胞經(jīng) 3H- 胸腺嘧啶核苷標(biāo)記后，所有 S 期細(xì)胞均被標(biāo)記。
② S 期細(xì)胞經(jīng) G2 期才進(jìn)入 M 期，所以一段時間內(nèi) PLM = 0。
③ 開始出現(xiàn)標(biāo)記 M 期細(xì)胞時，表示處于 S 期最后階段的細(xì)胞，已渡過 G2 期，所以從 PLM = 0 到出現(xiàn) PLM 的時間間隔為 G2期的持續(xù)時間。
④ S 期細(xì)胞逐漸進(jìn)入 M 期，PLM 上升，到達(dá)到最高點(diǎn)的時候說明來自處于 S 最后階段的細(xì)胞，已完成 M，進(jìn)入 G1 期。所以從開始出現(xiàn) M 到 PLM 達(dá)到最高點(diǎn) (≈ 100%) 的時間間隔就是 M 期的持續(xù)時間。
⑤ 當(dāng) PLM 開始下降時，表明處于 S 期最初階段的細(xì)胞也已進(jìn)入 M 期，所以出現(xiàn) LM 到 PLM 又開始下降的一段時間等于 S 期的持續(xù)時間。

二、流式細(xì)胞儀 PI 染色法

細(xì)胞周期分為間期與分裂期兩個階段。間期又分為三期：即 DNA 合成前期 ( G1 期 )、DNA 合成期 ( S 期 ) 與 DNA 合成后期 ( G2 期 )。某些細(xì)胞在分裂結(jié)束后暫時離開細(xì)胞周期，停止細(xì)胞分裂，執(zhí)行一定生物學(xué)功能 ( G0 期 )。

檢測細(xì)胞周期的原理：

由于細(xì)胞周期各時相的 DNA 含量不同，通常正常細(xì)胞的 G1 / G0 期具有二倍體細(xì)胞的 DNA 含量 ( 2N )，而 G2 / M 期具有四倍體細(xì)胞的 DNA 含量 (4N)，而 S 期的 DNA 含量介于二倍體和四倍體之間。PI可以與 DNA 結(jié)合，其熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi) DNA含量。因此，通過流式細(xì)胞儀 PI 染色法對細(xì)胞內(nèi) DNA 含量進(jìn)行檢測時，可以將細(xì)胞周期各時相區(qū)分為 G1 / G0 期，S 期和 G2 / M期，獲得的流式直方圖對應(yīng)的各細(xì)胞周期可通過特殊軟件計算各時相的細(xì)胞百分率。

三、基于成像的熒光檢測法

FUCCI (fluorescent ubiquitination-based cell-cycle indicator) 小球能鑒別細(xì)胞處在細(xì)胞周期的哪一時期，因此可以用來研究癌癥細(xì)胞周期的進(jìn)程。FUCCI 技術(shù)建立在鑒定過表達(dá)的兩種調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白 geminin 和 Cdt1 水平上，其中 geminin 融合的是綠色熒光基團(tuán) AmCyan，而 Cdt1 融合的是紅色熒光基團(tuán) mCherry。Cdt1 和 geminin 的水平隨著細(xì)胞周期的變化而不斷波動：Cdt1 蛋白水平在 G1 階段達(dá)到峰值，而 geminin 蛋白水平在 S，G2 和 M 期不斷升高。這一結(jié)果體現(xiàn)為表達(dá) FUCCI 細(xì)胞核在G1 期為紅色而在 S，G2 和 M 期則呈現(xiàn)綠色 ( 圖 2 )。

1 檢測方法

A375S FUCCI 球體準(zhǔn)備的方法如下：Corning 公司 96 孔 U 型底低吸附細(xì)胞培養(yǎng)板中加入含有 EGF (20 ng / mL) 和 B27 (1×)的 DMEM / F 12 培養(yǎng)基，按每孔 1,000 細(xì)胞進(jìn)行種板。細(xì)胞板離心 (800 g,6 min) 后在 37 ℃，5% CO₂條件下進(jìn)行孵育。最后，用含 10% FCS 的培養(yǎng)基清洗球體 3 次以移除 EGF 和 B27，繼續(xù)培養(yǎng) 1 至 6 天。

2 數(shù)據(jù)分析

MiniMax 細(xì)胞計數(shù)儀的透射光模塊可以從自動聚焦得到更好的圖像效果。SoftMax Pro 軟件中的“Field Analysis”能進(jìn)行自定義分析從而鑒別細(xì)胞重疊的部分。我們應(yīng)用一種特殊的鑒別方法來區(qū)分目標(biāo)球體和其余物體，如殘渣和個體細(xì)胞，從而在后續(xù)的分析中予以去除 (Figure 2, A and E)。最后，我們選擇感興趣的區(qū)域并從圖像中去除不想要的物體。在綠色和紅色熒光通道中，球體可以通過“Object Count”模式中大小和與背景相對熒光強(qiáng)度的區(qū)別被輕易的篩選出來 (Figure 2, B-D, F-G)。然后運(yùn)用SoftMax Pro 軟件計算圖像的“% Area coverage”和球體的“Object Area” (μm²)。圖像的獲取和分析的設(shè)置方法見表 1。

3 結(jié)果

SoftMax Pro 軟件中獲取及分析的設(shè)置可以在綠色和紅色熒光通道的透射光下簡便快速地分辨每個孔中的單球體。SoftMax Pro軟件還可計算所有通道包含的面積占比和物體面積 (μm²) (圖 3，表 2)。在綠色和紅色熒光通道下可以獲得最好的結(jié)果。對于 FUCCI 球體來說，圖 3 中紅色部分展示的是光滑圓潤的球體而綠色部分則在細(xì)胞表面，說明球體內(nèi)部的細(xì)胞處在 G1 期而表面細(xì)胞即將進(jìn)入 M 期。對應(yīng)軟件可以分辨球體大小和形狀 ( 球形參數(shù) ) 的各種變化，因此常用來研究多種處理，如抗癌藥物，對細(xì)胞增殖的影響 ( 圖4 )。MiniMax 中綠色和紅色熒光的光學(xué)成形功能可以將 3D 圖像轉(zhuǎn)換為 2D 投射球體圖。

四、高內(nèi)涵檢測法

方法

1. 準(zhǔn)備細(xì)胞懸液，40,000 細(xì)胞 / mL 的 Hela 細(xì)胞懸液與 30 顆粒 / 細(xì)胞濃度的 FUCCI 試劑混合，以 4,000 細(xì)胞 / 孔的濃度種在 96 孔板中，孔板置于 37 °C，5% CO2 的環(huán)境下貼壁 8 小時。
2. 不同濃度的有絲分裂抑制劑處理細(xì)胞，然后孔板放入 ImageXpress Micro 系統(tǒng)。
3. 每隔 2-3 小時系統(tǒng)自動拍攝一次圖片，使用 20 倍 Plan Apo 物鏡，同時獲取明場及兩個熒光通道 FITC 和 TRITC 的圖像。實(shí)驗(yàn)持續(xù) 48 - 72 小時，細(xì)胞可完成 1 - 2 次分裂。
4. 分析延遲實(shí)驗(yàn)圖像使用 MetaXpress^® 高內(nèi)涵成像與分析軟件的用戶自定義模塊。

Premo^® FUCCI 細(xì)胞周期指示劑結(jié)合配置環(huán)境控制的 ImageXpress Micro 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)和 MetaXpress 高內(nèi)涵分析軟件，可實(shí)現(xiàn)高效的活細(xì)胞周期精確測量。高通量篩選技術(shù)可為科學(xué)家提供一個快速、自動的基于圖像定量分析細(xì)胞周期的方法，并能夠完整地記錄長時間內(nèi)的細(xì)胞周期變化。另外，MetaXpress 軟件能夠在明場圖像識別細(xì)胞，避免了染料對活細(xì)胞的毒性。同一標(biāo)準(zhǔn)具有統(tǒng)計學(xué)意義的定量分析方法可評價多化合物在不同濃度對細(xì)胞周期影響的相關(guān)參數(shù)。