一、簡介

靶向細(xì)胞的科研研究和藥物研發(fā)避免不了細(xì)胞活力的分析和追蹤。但依據(jù)實(shí)驗(yàn)的最終目的和關(guān)注參數(shù)的不同，細(xì)胞活力的體現(xiàn)，檢測方法也會不一樣。例如細(xì)胞增殖檢測適用于比較不同細(xì)胞株增殖能力，而細(xì)胞毒性分析則可以用于探究候選藥物是否有細(xì)胞毒性等。從分析儀器上來說，現(xiàn)階段主流的檢測平臺，如顯微鏡，流式細(xì)胞儀和實(shí)時熒光定量pcr儀等都可用于細(xì)胞活力的分析，但不同的平臺所關(guān)注的指標(biāo)，靈敏度和通量會有所差異，因此需要依據(jù)所回答的生物學(xué)問題和指標(biāo)選擇合適的檢測平臺。在上述平臺中，酶標(biāo)儀提供了96、384孔板的高通量細(xì)胞活力檢測方法，靈敏度上能和經(jīng)典的[3H]胸腺嘧啶摻入法(Thymidine Incorporation Assay)相媲美，因此成為了主流的科研和工業(yè)研發(fā)中細(xì)胞活力和毒性分析平臺。相應(yīng)的，細(xì)胞活力分析也成為了酶標(biāo)儀的基礎(chǔ)應(yīng)用之一，也是Molecular Devices (MD)關(guān)注的主要應(yīng)用。

 

在本手冊中，我們會從酶標(biāo)儀出發(fā)向大家介紹，對比主流的細(xì)胞活力，毒性分析方法，并通過詳細(xì)的應(yīng)用材料向大家展示如何應(yīng)用MD酶標(biāo)儀和軟件輕松，專業(yè)的完成細(xì)胞活力，毒性分析。
 

 

二、細(xì)胞活力分析

此部分主要關(guān)注常見的細(xì)胞活力分析方法，如MTT和ATP法等。雖然這些檢測方法也常用于分析藥物毒性和安全性，但相較于乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測等方法，它們更關(guān)注細(xì)胞活力的變化。依據(jù)原理的不同，細(xì)胞活力檢測方法主要分代謝法，酶活法和ATP法。

 

2.1 代謝法

2.1.1原理和介紹

代謝法是最常見的細(xì)胞增殖檢測方法，其主要包括四氮唑還原法(Tetrazolium reduction)，如MTT和CCK-8法等，和刃天青還原法(Resazurin Reduction)，如alamarBlue法等。這些方法的原理都是基于細(xì)胞的代謝能力還原孵育的底物，其產(chǎn)物通常具有光吸收或熒光屬性，因此能用酶標(biāo)儀進(jìn)行高通量細(xì)胞活力分析。

 

上述方法中，最常見的是MTT法，其屬于酶標(biāo)儀光吸收應(yīng)用，利用細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶對MTT的還原，形成不溶于水的結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中和細(xì)胞外。最后使用特定的有機(jī)溶劑，如二甲基亞砜(DMSO)等溶解后進(jìn)行 570 nm處檢測[圖一]。由于MTT本身具有正電荷，因此容易進(jìn)入細(xì)胞，并具有一定的代謝毒性。同時，確切上說，MTT法是檢測細(xì)胞線粒體的代謝活力。

圖一，MTT法原理，圖片來源于https://en.wikipedia.org/wiki/MTT_assay

 

近年來在MTT的基礎(chǔ)上一系列類似結(jié)構(gòu)的底物被應(yīng)用于細(xì)胞增殖活力檢測中，主要包括MTS, XTT, 和WST等，它們同樣屬于酶標(biāo)儀光吸收應(yīng)用。與MTT不同，這些底物本身具有負(fù)電荷，因此不易進(jìn)入細(xì)胞，同時其還原產(chǎn)物可溶于水，因此無需溶解結(jié)晶步驟，提升了實(shí)驗(yàn)的操作性和穩(wěn)定性。該系列中，最常見的是基于WST-8的Cell Counting Kit-8(CCK-8法)。相較于僅依賴線粒體脫氫酶的MTT法，CCK-8法基于細(xì)胞內(nèi)多數(shù)的脫氫酶，因此其檢測活力更為準(zhǔn)確，靈敏度更高，同時降低了細(xì)胞毒性[圖二]。由于省去了溶解步驟，CCK-8法支持動力學(xué)檢測，提高了實(shí)驗(yàn)的靈活性。同時因其毒性低，細(xì)胞在完成CCK-8法檢測后還可以用于后續(xù)的其他檢測。

圖二，CCK-8法原理，圖片來源于

 

上述的代謝法均屬于酶標(biāo)儀光吸收應(yīng)用，雖然相對經(jīng)濟(jì)，但還是會受到光吸收本身的多種限制，尤其是動態(tài)范圍窄，容易受到具有光吸收特性的試劑和藥物干擾等。同時，光吸收法受限于比爾定律中的光徑因素，不適用于384或1536孔板等更高通量檢測等。因此，基于熒光檢測的代謝法也成為了主要的細(xì)胞活力檢測方法之一，其中常見的是基于刃天青還原的alamarBlue法。

 

原理上alamarBlue法與MTT和CCK-8法類似，利用增殖中的細(xì)胞固有的代謝能力進(jìn)行還原無色，無熒光的刃天青，所得的紅色產(chǎn)物resorufin具有強(qiáng)熒光特性，因此可用支持熒光或光吸收的酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，提升了檢測的靈活性和抗干擾能力[圖三]。支持熒光檢測的alamarBlue法可具有3-4個動態(tài)數(shù)量級，具有更寬的檢測范圍和更高的靈敏度。同時，還原產(chǎn)物可溶于水，低毒，因此和CCK-8一樣支持動力學(xué)檢測和多重檢測。然而，alamarBlue法更為穩(wěn)定，因此非常適合追蹤細(xì)胞的增殖變化。

 

圖三，alamarBlue反應(yīng)前后的熒光(左，530-560 nm 激發(fā))和光吸收變化(右)，圖片來自于Invitrogen 技術(shù)材料

 

2.1.2 Molecular Devices的支持

針對于代謝法MD主要提供硬件和軟件的支持，其中，硬件上配備光吸收的單功能和多功能酶標(biāo)儀，如cMAX plus，Spectra-Max M系列等都支持MTT法和CCK-8法的高通量檢測。對應(yīng)的，具有熒光檢測功能的酶標(biāo)儀，如SpectraMax iD3/5，SpectraMax Gemini EM，SpectraMax i3X和M系列都推薦用于熒光法細(xì)胞活力檢測。軟件上，一方面Softmax Pro 7 模板庫中的Cell Growth &Viability已經(jīng)預(yù)設(shè)了一些常用的方法模板，如alamarBlue法和MTS法。類似的方法只需在預(yù)設(shè)的模板上改變檢測參數(shù)即可，同時，修改后的模板可另存為新的模板方便后續(xù)的檢測。另外一方面，軟件支持多種形式的數(shù)據(jù)處理，包括雙波長矯正，空白扣除，數(shù)據(jù)均一化到后期的線性、四參數(shù)擬合等等，極大的簡便了分析過程，提高分析效率和一致性。

 

2.1.3 常見實(shí)驗(yàn)流程和注意事項(xiàng)

代謝法的實(shí)驗(yàn)流程基本一致，以MTT法為例[圖五]，主要分為以下幾個步驟。

a) 預(yù)鋪細(xì)胞于96孔板中，細(xì)胞密度需要根據(jù)細(xì)胞系本身和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?增殖活力還是藥物毒性篩選)進(jìn)行優(yōu)化。一般來說，懸浮細(xì)胞的密度要高于貼壁細(xì)胞。板型上光吸收法推薦透明板，熒光法推薦黑邊底部透明板。

b) 按照需求進(jìn)行化合物或類似處理，此步的實(shí)驗(yàn)需要優(yōu)化藥物的起始處理時間和孵育時間，留意代謝法需要細(xì)胞代謝加入的底物，因此需要維持細(xì)胞在增殖階段進(jìn)行下一步染色。此步中還需要留意對照的選擇和設(shè)置，包括系統(tǒng)對照（只有細(xì)胞或只有MTT染料加藥物等）和陽性對照(細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)中溶劑處理組等)。

c) 進(jìn)行底物孵育，此步需要優(yōu)化底物孵育的時間和濃度。留意熒光法此步注意避光。

d) 溶解反應(yīng)出的結(jié)晶，此步需要確保結(jié)晶的完全溶解，同時要確保溶解產(chǎn)物不影響最后的檢測，通常酸化的溶解會避免酚紅對最后檢測帶來的影響。CCK-8法和alamarBlue法無需此步

e) 應(yīng)用酶標(biāo)儀進(jìn)行單波長或者雙波長檢測。一般MTT法單波長為570 nm，雙波長為 570 nm-630~690 nm 檢測，用于矯正細(xì)胞碎片或濁度干擾[圖五]。如果是熒光法，則按照推薦參數(shù)進(jìn)行熒光檢測。CCK-8法和alamarBlue法此步可按需求進(jìn)行動力學(xué)檢測。在進(jìn)行動力學(xué)檢測時，推薦酶標(biāo)儀先預(yù)熱至37°C。

處理和分析結(jié)果，相關(guān)的雙波長矯正，均一化和線性/四參數(shù)擬合等可在Softmax Pro軟件中自行完成。

 

代謝法的底物都是通過還原反應(yīng)進(jìn)行檢測，因此會受到具有還原能力的化合物和試劑的影響。此外，具有光吸收屬性和熒光屬性的化合物可能會影響光吸收法，如MTT法和CCK-8法和熒光法如alamarBlue法的檢測結(jié)果。對于上述影響，一方面可以通過直接混合化合物和底物檢測排除，一方面可通過其他的細(xì)胞活力檢測方法進(jìn)一步分析。

2.2 酶法

2.2.1 原理和介紹

2.2.2 Molecular Devices的支持

2.2.3 常見實(shí)驗(yàn)流程和注意事項(xiàng)

2.3 ATP法

2.3.1 原理和介紹

2.3.2 Molecular Devices的支持

2.3.3 常見實(shí)驗(yàn)流程和注意事項(xiàng)

 

三、細(xì)胞毒性和殺傷分析

雖然上述的細(xì)胞活力分析方法被廣泛的用于毒性分析，但其從細(xì)胞活性的變化為出發(fā)點(diǎn)，不是直接的分析細(xì)胞毒性，同時，隨著免疫領(lǐng)域的興起，越來越多的研究開始關(guān)注直接的細(xì)胞毒性，尤其是細(xì)胞裂解情況的檢測。在此章中，我們會像大家介紹一些常見的，偏向由免疫細(xì)胞殺傷對應(yīng)的毒性的檢測。

 

3.1 LDH 細(xì)胞毒性法

3.2 Calcein 釋放法

3.3 熒光素酶釋放法