導(dǎo)語

你正在細胞科學的海洋愉快遨游，如果有一天，細胞污染忽然跑過來說：“大家好，我是細胞污染~”這時候，科研的小船說翻就翻。

今天Esco就同大家淺談細胞污染，拋磚引玉。

體外細胞污染分類: 物理性、化學性、生物性污染。其中生物性污染常見且造成的后果也較為嚴重，培養(yǎng)的細胞一旦遭到微生物污染，將具有不可逆轉(zhuǎn)性。輕則污染細胞廢棄，重則連帶污染培養(yǎng)箱內(nèi)的其他細胞，甚至整個實驗室的環(huán)境，給科研工作帶來嚴重的損失和威脅。

一、怎樣判斷你的細胞是何種生物性污染？

1.細菌污染

常見細菌種類為大腸桿菌、枯草桿菌、假單胞菌等(革蘭陰性菌)、 葡萄球菌等(革蘭陽性菌)，其中革蘭陽性菌較為多見。

主要來源：操作不當或是器材消毒不嚴，或是各種營養(yǎng)成分隱性污染細菌沒有被檢測出來所造成的。

特點：污染速度快，易被發(fā)現(xiàn)。多數(shù)情況下細胞培養(yǎng)液短時間內(nèi)變黃，培養(yǎng)基1～2d就會變渾濁，pH值降低，倒置顯微鏡下觀察，可見胞漿出現(xiàn)大量顆粒，細胞變圓或崩潰，從壁上脫落，培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，呈細沙狀，污染較輕時可見小菌體在細胞間運動。

圖1 細菌污染

圖2 洋蔥佰克霍爾德菌污染

2.真菌污染

污染培養(yǎng)細胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。

主要來源：實驗人員（實驗服）

特點：短期內(nèi)不會引起培養(yǎng)液的渾濁，可在培養(yǎng)液中形成白色或黃色漂浮物，一般肉眼可見，較易被發(fā)現(xiàn)，4d左右才可在高倍鏡下觀察到絲狀、管狀或樹枝狀菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養(yǎng)基中，有些真菌開始很像死細胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細胞碎片分不清，慢慢的會長出很細的黑色絲狀物。

圖3 真菌污染

圖4 霉菌（絲霉）污染 培養(yǎng)基呈淡紫色，或不變色，但會變得粘稠，并且具有季節(jié)性，長蘑菇的季節(jié)很容易污染這種菌類。

念珠菌污染呈鏈狀排列，呈卵圓形散在細胞周邊和細胞之間。

圖5 白色念珠菌污染 常見的細胞污染之一，左側(cè)為倒置顯微鏡下視圖，右側(cè)為革蘭氏染色圖片，其中，長梭型的是處于分裂期的鏈珠菌

酵母污染很容易觀察到，培養(yǎng)物變渾濁，尤其在后期。一般pH值變化很小，嚴重時，pH值升高。顯微鏡下呈卵圓形或球形顆粒，有些會芽生較小顆粒。

圖6 酵母菌污染

3.支原體污染

支原體是一類無細胞壁、大小介于細菌和病毒之間（直徑在0.13～0.18 μm）并獨立生活的微生物，可穿過0.22 μm 的孔徑濾膜！光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)！并對青霉素有抗藥性！簡直就是細胞培養(yǎng)界的隱性殺手有木有！

主要來源：血清

特點：支原體污染不能用肉眼或光學顯微鏡檢查細胞觀察出來，帶有一定的隱蔽性，易被人們忽視。當細胞被支原體污染后，在光鏡下�？梢姷郊毎�核及胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的顆粒或空泡，細胞營養(yǎng)液可能毫無變化，短期內(nèi)細胞沒有明顯的病理變化，也可以因為傳代或換液而緩解。只有當污染嚴重時才影響細胞增殖，使細胞脫落。支原體可以與宿主細胞形成一個共生關(guān)系，使污染不斷擴大。一旦發(fā)生支原體污染，支原體可以通過移液、傾倒液體時產(chǎn)生具有潛在感染力的飛沫和吸附的塵埃，沉積在物體表面。這種污染性塵埃能存活數(shù)天甚至數(shù)周，使操作環(huán)境受到污染，若不及時處理還會產(chǎn)生交叉污染或再次污染。

檢測：常用的檢查方法為培養(yǎng)檢測法，即取1mL細胞培養(yǎng)液加入支原體液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5天后，觀察培養(yǎng)基的顏色變化。如果變黃則懷疑該細胞受到支原體污染。如果不變色，則盲傳一代。若顏色變黃，可接支原體固體培養(yǎng)基，于5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5天，觀察有無“煎蛋”狀支原體菌落。一旦發(fā)生污染即淘汰該細胞和培養(yǎng)液。

圖7 支原體污染 煎蛋狀和其他形狀，左側(cè)：電鏡照片(×30k)； 右側(cè)：電鏡照片（×12k）

此外，支原體污染還可用熒光染色法和相差顯微鏡觀察法等檢測方法,或者直接購買支原體檢測試劑盒進行檢測。

4.黑膠蟲污染

黑蛟蟲是一種生物還是非生物，學術(shù)界還有爭論。可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播。

主要來源：血清

特點：開始污染時對細胞無影響，當數(shù)量達到一定程度時就會對細胞產(chǎn)生影響。400倍顯微鏡下可見點狀或片狀游動小體。，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會太影響，細胞還是可以用的。常常是細胞生長狀態(tài)良好，且觀測到的運動物無明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無明顯變化，可在同一批號的血清養(yǎng)的細胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。對細胞生長狀態(tài)不會有明顯影響，在細胞增殖旺盛之后會自然消失，除更換血清外無須特殊處理。

5.病毒污染

盡管病毒污染的細胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。

主要來源：動物血清或者細胞系，常見于雜交瘤細胞。

特點：極為隱蔽，很難用常規(guī)的方法檢測到。受病毒污染的細胞液通常清亮無變化，大多數(shù)受病毒污染的細胞不會產(chǎn)生形態(tài)變化及細胞病理現(xiàn)象，少部分病毒會造成細胞變圓、腫脹，脫落。

檢測：可用血細胞吸附試驗、免疫熒光抗體法及電子顯微鏡法有效檢出病毒。通常病毒物污染的清除是十分困難的，可以重新引入高質(zhì)量的細胞株。

6.非同種細胞污染

即細胞交叉污染，一般來自細胞建株和細胞傳代過程中兩種或兩種以上細胞之間的混合污染。一種是由于細胞培養(yǎng)操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開，往往會使一種細胞被另一種細胞污染，另一種情況則是提取原代細胞時在消化過程中由于剪割的組織塊不夠純，消化時間把握不好，容易把雜質(zhì)細胞消化混入原代細胞培養(yǎng)中。

二、預(yù)防細胞污染

1.室內(nèi)環(huán)境

(1)細胞培養(yǎng)室要有操作間、緩沖間和更衣室；

(2)房間裝修密閉性較高，且不宜開設(shè)外窗，無菌間的房頂、墻壁和地面均應(yīng)光滑、無死角，室內(nèi)應(yīng)有紫外線殺菌裝置；

(3)實驗臺和儀器布局應(yīng)合理。一般來說，二氧化碳培養(yǎng)箱和凈化工作臺或生物安全柜不應(yīng)對著門擺放，離心機和顯微鏡不應(yīng)離得太遠。

2.實驗用品

(1)購買合格的細胞，并留種凍存，必要時可將細胞懸液加入肉湯培養(yǎng)基或瓊脂培養(yǎng)基中，觀察是否有微生物滋生；

(2)細胞培養(yǎng)所用物品的清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細，操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌；

(3)細胞培養(yǎng)過程中涉及到的自行配制的溶液要經(jīng)過高壓濕熱滅菌（如水、磷酸鹽緩沖溶液等）或0.22μm無菌濾膜過濾（不耐高溫的溶液）、并檢測確認為無菌后，方可使用；

(4)不同細胞在傳代或換液時所用器具應(yīng)嚴格區(qū)分，避免細胞間交叉污染。

3.實驗人員

(1)操作人員進培養(yǎng)室前，必須先洗手，在緩沖間換穿專用實驗服和拖鞋，嚴禁在實驗進行時頻繁出入培養(yǎng)室；

(2)操作要準確、敏捷、有序；

(3)吸取溶液時，應(yīng)專管專用，避免交叉污染；

(4)吸管管口要向下傾斜， 以防止液體倒流進入移液器內(nèi)發(fā)生污染；盡量減少細胞和培養(yǎng)基的敞口時間；

(5)已開口的試劑瓶盡可能的傾斜放置，防止下落微生物的污染；

(6)避免在敞口的細胞培養(yǎng)皿及培養(yǎng)皿蓋上方操作；不要面對工作臺或細胞培養(yǎng)箱講話或咳嗽，防止口腔微生物隨唾沫飛入而發(fā)生污染；

(7)若發(fā)生外溢，用蘸有消毒酒精的棉球及時擦去；

(8)實驗后應(yīng)將實驗產(chǎn)生的廢物和廢液及時清理出培養(yǎng)室，并清潔無菌工作臺。

三、結(jié)語

讀完了本文，您是否對細胞污染有了更多的了解呢？您知道應(yīng)該怎樣預(yù)防細胞污染了嗎？

之前Esco發(fā)過題為《如何保護您的培養(yǎng)細胞免受污染》一文，如果感興趣的話，可以前往我們的官網(wǎng)展開了解，或者關(guān)注Esco生命科學的微信公眾號：Esco_China，進一步了解更多關(guān)于細胞培養(yǎng)的相關(guān)內(nèi)容。