簡(jiǎn)介

單純皰疹病毒2型（HSV-2）是潰瘍性生殖器皰疹的主要病原，全球每年新增感染達(dá)2300萬例，其治療方式主要圍繞口服抗病毒治療展開，但已有HSV-2候選疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)，包括滅活、活性衰減、亞單位、DNA及多肽疫苗等，其中，野生型病毒刪除UL5和UL29基因構(gòu)建的復(fù)制缺陷型HSV-2疫苗株病毒（dl5-29再衍生，并重命名為ACAM529）被認(rèn)為是較有效的候選疫苗，在小鼠和豚鼠體內(nèi)都有效誘導(dǎo)了保護(hù)性免疫反應(yīng)。但傳統(tǒng)使用疫苗經(jīng)離心純化方法制備，該技術(shù)不適用于商業(yè)化生產(chǎn)。

臨床用病毒疫苗的制備包括上游病毒生產(chǎn)和下游病毒純化，后者需維持病毒感染性，并清除宿主細(xì)胞雜質(zhì)。已有多種方法用于純化細(xì)胞培養(yǎng)衍生病毒顆粒，本實(shí)驗(yàn)使用膜層析結(jié)合中空纖維切向流過濾（TFF）制備高純度、功能性ACAM529疫苗，主要步驟包括使用硫酸葡萄糖（DS）從感染的互補(bǔ)Vero細(xì)胞培養(yǎng)中洗提ACAM529、核酸內(nèi)切酶處理、深層過濾、陰離子交換層析、中空纖維切向流過濾，處理獲得的疫苗株病毒純度較高，且具有良好的免疫源性。

實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)使用Vero細(xì)胞系A(chǔ)V529-19，按已有方法制備ACAM529主病毒種子庫(kù)。小規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)使用12孔板和T125搖瓶，然后放大至10層NUNC細(xì)胞工廠（NCF，工作體積2L，培養(yǎng)面積6320cm2，Thermo Fisher），對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以確保ACAM529產(chǎn)率最大化。

實(shí)驗(yàn)使用兩種方法純化ACAM529，第一種方法使用平面膜包式切向流過濾結(jié)合蔗糖墊層超速離心，具體操作包括從NCF手動(dòng)刮離感染細(xì)胞，離心后加入穩(wěn)定緩沖液重懸，細(xì)胞懸液加入微流機(jī)（Microfluidics Corporation）機(jī)械破碎細(xì)胞并切斷細(xì)胞基因組DNA，然后加入Benzonase^®核酸內(nèi)切酶(Merck Millipore)處理后，離心澄清。澄清后的細(xì)胞裂解液使用配有3個(gè)30kD、50cm²聚醚砜板式膜的過濾系統(tǒng)從1100mL濃縮至50mL，過濾過程中，入口壓力維持為30psi，背壓從1psi上升至8psi，以達(dá)到足夠的流速。過濾后的回流液使用25%蔗糖墊層超速離心處理4h（50,000×g，4℃），并將獲得的ACAM529顆粒重懸于20%蔗糖穩(wěn)定緩沖液，-80℃儲(chǔ)存。

第二種方法使用膜層析結(jié)合中空纖維切向流過濾。具體操作時(shí)，先倒出NCF中的感染培養(yǎng)基，加入DS洗提緩沖液，孵育后離心澄清，加入Benzonase^®反應(yīng)液，溫和攪拌，反應(yīng)特定時(shí)間后，使用0.65μm深層過濾器過濾清除殘留的細(xì)胞碎片及其它聚集雜質(zhì)。膜層析使用Mustang^®Q濾芯（Pall Corporation），操作前先滅菌、預(yù)濕、低鹽平衡，上樣后用平衡緩沖液漂洗，然后用0.7M NaCl緩沖液洗脫雜質(zhì)，再用2MNaCl緩沖液洗脫含ACAM529餾分，后者使用KrosFlo^® 研發(fā)用IIi 切向流過濾系統(tǒng)（產(chǎn)品編號(hào)：SYR2-U20-01N；配100kD、85cm²聚砜中空纖維過濾組件）濃縮5-10倍，并進(jìn)行3-5體積洗濾后換液至20%蔗糖穩(wěn)定緩沖液。操作過程中，為降低剪切，流速設(shè)定為130mL/min（剪切約為4,000S^-1）。洗濾時(shí)，跨膜壓（TMP）控制為4psi以下，以減緩凝膠層形成。產(chǎn)物于-80℃保存。所有操作在無菌條件下進(jìn)行，因HSV-2病毒顆粒較大（180-200nm），無法對(duì)終產(chǎn)物進(jìn)行除菌過濾。

產(chǎn)物純化后，測(cè)定ACAM529滴度，并使用ELISA、qPCR及PicoGreen dsDNA分析法檢測(cè)ACAM529純度，免疫源性通過小鼠皮下免疫實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。

結(jié)果

使用蔗糖墊層超速離心進(jìn)行ACAM529實(shí)驗(yàn)室規(guī)模制備時(shí)，每1 X 107 PFU ACAM529中會(huì)有2μg以上的宿主細(xì)胞DNA殘留，而使用本實(shí)驗(yàn)方法二時(shí)，殘留量低于10ng，如以宿主細(xì)胞蛋白殘留為衡量標(biāo)準(zhǔn)，該方法產(chǎn)物純度高出200倍，而工藝處理液雜質(zhì)為衡量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，純度高出2個(gè)數(shù)量級(jí)。

使用機(jī)械細(xì)胞破碎時(shí)，產(chǎn)物中會(huì)有較高的dsDNA殘留。替代方法是使用DS，從宿主細(xì)胞表面有效化學(xué)洗提獲得ACAM529，并使用Benzonase^®核酸內(nèi)切酶降低產(chǎn)物中的DNA載量。

在比較了一系列層析方法后發(fā)現(xiàn)，使用Mustang^® Q膜層析濾芯所獲得的階段收率最高，而使用KrosFlo^®中空纖維切向流過濾系統(tǒng)替換板式膜過濾系統(tǒng)，可有效使收率加倍，原因可能是開放式流道降低了剪切，而在板式膜設(shè)計(jì)中增加了用于形成湍流的篩網(wǎng)，雖然篩網(wǎng)在一定程度上可提高流速，降低凝膠層形成，但同時(shí)亦增加對(duì)樣品的剪切力。

如以產(chǎn)物中Vero宿主細(xì)胞蛋白（HCP）為衡量標(biāo)準(zhǔn)，ACAM529終產(chǎn)物純化因子可達(dá)250倍，而Vero DNA含量亦低于WHO規(guī)定限量。純化過程中加入的DS、Benzonase^®等可分別在深層過濾及膜層析過程中清除。此外，動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)表明，層析純化獲得的ACAM529具有與蔗糖墊層離心純化獲得的樣品一致的免疫源性和保護(hù)性。

討論

ACAM529是一種復(fù)制缺陷的預(yù)防性候選疫苗，在初步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已證明其效力，但為滿足進(jìn)一步的動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)需要，急需一種可規(guī)模放大的下游純化工藝。本實(shí)驗(yàn)使用方法結(jié)合DS洗提、Benzonase^®處理、深層過濾、膜層析及中空纖維超濾/洗濾，有效提高了疫苗總收率。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，流體動(dòng)力學(xué)剪切壓力對(duì)于感染性病毒滴度的損耗非常關(guān)鍵，所以將封閉流道板式膜TFF及微珠層析更換成開放流道的中空纖維TFF及膜層析，從而在純化步驟的每個(gè)階段都可獲得更高的感染性病毒收率。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中獲得的疫苗免疫源性及保護(hù)性效力數(shù)據(jù)，也確認(rèn)了工藝的可行性。

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原文：Mundle, S.T., Hernandez, H., Hamberger, J., etal., High-Purity Preparation of HSV-2 Vaccine Candidate ACAM529 Is Immunogenicand Efficacious In Vivo. PLOS ONE,2013, 8(2):1-10.