細(xì)胞P38α激酶活性光度法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

YIJI細(xì)胞P38α激酶活性光度法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)多肽底物，在P38α激酶敏感性抑制劑存在與否的情況下，受到P38α磷酸化后，進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測(cè)定產(chǎn)生ADP過(guò)程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光度法測(cè)定其氧化后吸光峰值的變化，以分析細(xì)胞裂解樣品中P38α活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、部分或完全純化酶樣品中P38α激酶的定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

技術(shù)背景

P38促分裂素原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinases；P38MAPK；EC2.7.11.24），又稱為細(xì)胞分裂素特異性結(jié)合蛋白（Cytokinin Specific Binding Protein；CSBP），屬于促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）一類中，包括JNK（c-Jun amino terminal kinase）、ERK（細(xì)胞外信號(hào)相關(guān)激酶；extracellular signal related kinase）、P38、Big MAPK1等的一員。酵母的同源基因?yàn)镠og1p。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，促分裂素原活化蛋白激酶通路包含有三大通路，P38信號(hào)通路是其中之一。P38MAPK屬于絲氨酸//蘇氨酸（serine/threonine）蛋白激酶家屬。和ERK和JNK通路一起，將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)化為特定細(xì)胞反應(yīng)。P38通路受到各種促炎性刺激（proinflammatory stimuli）例如生長(zhǎng)因子、激素、GPCR配體、促炎性細(xì)胞因子白介素1和8、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等，以及細(xì)胞應(yīng)激（UV、滲透壓休克osmotic shock、內(nèi)毒素、熱休克、化學(xué)毒素等）而活化，通過(guò)MAPK激酶3和6（MKK3和6）、Jun N-terminal kinase kinase1，以及與MAP3k7IP1/TAB1反應(yīng)，獲得磷酸化后，由胞漿轉(zhuǎn)移到胞核，進(jìn)而激活下游MK2、MK3、PARK、Mac、MSK、MNK1、轉(zhuǎn)錄因子（STAT1、NFAT、ATF2、MEF2C、P53、CHOP、MAX、CDC25B）、MnSOD等，達(dá)到調(diào)節(jié)促炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)譯、各種細(xì)胞外刺激的基因表達(dá)、細(xì)胞周期、分化、凋亡的調(diào)節(jié)、TNFα、IL1、COX2的生物合成等功能。P38通路異常，將導(dǎo)致風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)、銀屑病（psoriasis）和癌癥等，由此P38成為藥物靶標(biāo)。P38 MAPK蛋白激酶有5個(gè)亞酶，包括α（MAPK14/SAPK2A）、β（MAPK11）、γ（MAPK12/ERK6/SAPK3）、δ（MAPK13/SAPK4）、P38-2。其中P38α為廣譜表達(dá)，由MAP激酶激酶（MKK）激活以及MAP3K7IP/TAB1蛋白反應(yīng)后激活，其作用底物為ATF2、MEF2C、MAX、CDC2B、P53等，與細(xì)胞繁殖、分化、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、炎性反應(yīng)、細(xì)胞因子合成、發(fā)育（紅細(xì)胞、胎盤）等有關(guān)；P38β為廣譜表達(dá)，主要由MAP激酶激酶6（MKK6）激活，其作用底物為ATF2/CREB2；P38γ主要在骨骼肌組織表達(dá)，是成肌細(xì)胞（myoblast）分化為肌管（myotube）的信號(hào)傳導(dǎo)者；P38δ在肺、胰腺、腎、小腸、睪丸等組織高表達(dá)，主要由MAP激酶激酶3和6（MKK3和6）激活，其作用底物為ATF2、Tau、Stathmin、eEF2K等，與角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocyte）分化有關(guān)。P38α磷酸化目標(biāo)序列為IPTTPITTTYFFFKKK�；�于底物IPTTPITTTYFFFKKK，在P38α敏感性抑制劑SD169的存在與否的情況下，受到P38a激酶的磷酸化，獲得產(chǎn)物磷酸化多肽，進(jìn)而通過(guò)丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來(lái)定量分析P38a激酶的活性。其反應(yīng)方式為：

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI清理液（Reagent A）  毫升

YIJI裂解液（Reagent B）  毫升

YIJI緩沖液（Reagent C）  毫升

YIJI酶促液（Reagent D）  微升

YIJI反應(yīng)液（Reagent E）  微升

YIJI底物液（Reagent F）  微升

YIJI陰性液（Reagent G）  微升

YIJI專性液（Reagent H）  微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)     1份

 

保存方式

保存YIJI清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

 

用戶自備

P38α激酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品預(yù)處理

比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光度分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

• 待測(cè)樣品準(zhǔn)備
• 準(zhǔn)備好75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁷細(xì)胞）
• 小心加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升YIJI裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

• 測(cè)定準(zhǔn)備
• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解懸液等），置于冰槽里 
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零
• YIJI緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

• 背景對(duì)照測(cè)定

 

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入xx微升YIJI陰性液（Reagent G）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘 

 

• 樣品總活性測(cè)定

 

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入5微升待測(cè)樣品（注意：50微克細(xì)胞裂解蛋白；樣品須溶解）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘 

 

• 樣品非特異活性測(cè)定

 

檢測(cè)開(kāi)始前，移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管，分別加入xx微升YIJI專性液（Reagent H）和待測(cè)樣品（注意：50微克細(xì)胞裂解蛋白），混勻后，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

 

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F） 
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入20微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品非特異活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘

 

• 計(jì)算樣品活性

 

• 樣品總活性和非特異活性計(jì)算

 

 

2）樣品特異活性計(jì)算

 

 

七、酶標(biāo)儀測(cè)定

 

• 樣品總活性測(cè)定

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 分別加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 分別加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入xx微升YIJI陰性液（Reagent G）或待測(cè)樣品（50微克細(xì)胞裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
• 活性計(jì)算：

 

 

• 樣品非特異活性測(cè)定

 

檢測(cè)開(kāi)始前，移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管，分別加入xx微升YIJI專性液（Reagent H）和待測(cè)樣品（注意：50微克細(xì)胞裂解蛋白），混勻后，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：待測(cè)樣品
• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F） 
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
• 活性計(jì)算：

 

 

• 樣品特異活性計(jì)算

 

 

八、抑制劑篩選

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、完全活性和待測(cè)抑制劑樣品
• 按下表加入試劑，進(jìn)行樣品預(yù)處理

 

內(nèi)容物	空背景對(duì)照	樣本背景	完全酶活性	待測(cè)抑制劑酶活性
YIJI緩沖液（Reagent C）	xx微升	xx微升	xx微升	xx微升
YIJI陰性液（Reagent G）	xx微升	xx微升	xx微升	——
待測(cè)抑制劑	——	xx微升	――	xx微升
用戶自備的純化酶	——	——	xx微升（1毫單位）	xx微升（1毫單位）
96孔板每孔總量	空背景對(duì)照孔 （xx微升）	樣本背景孔 （xx微升）	完全活性孔 （xx微升）	待測(cè)抑制劑樣品孔 （xx微升）
輕輕搖動(dòng)96孔板，混勻，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后進(jìn)行下列操作

 

• 分別移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
• 分別加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 分別加入xx微升YIJI底物液（Reagent F） 
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
• 即刻放進(jìn)30℃酶標(biāo)儀檢測(cè)：測(cè)讀30分鐘
• 抑制活性計(jì)算：

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
• 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 如果出現(xiàn)明顯的干擾現(xiàn)象，建議使用樣本背景對(duì)照去除任何內(nèi)源性干擾因子
• 加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光度測(cè)定
• 測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定可持續(xù)30分鐘
• 光度測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測(cè)定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供 YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
• 可以使用P38α抑制劑（VX745；IC50=10納摩爾）作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照
• P38α激酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.6條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列蛋白激酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感