DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A活性酶連續(xù)循環(huán)比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書

（中文版）

 

主要用途

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNMT3A）活性酶連續(xù)循環(huán)比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用合成人工合成甲基受體底物分子和抑制復(fù)合物，通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、腺苷同型半胱氨酸核苷酶、腺嘌呤脫氨酶和黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)中生成過氧化氫，使用顯色染料和過氧化酶后，產(chǎn)生醌亞胺產(chǎn)物吸光峰值的變化，即采用比色法來測(cè)定細(xì)胞或組織裂解樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞或組織裂解懸液樣品（動(dòng)物、人體等）DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

生物分子的甲基化在各種生物體系統(tǒng)里，諸如信號(hào)傳導(dǎo)、生物合成、蛋白修復(fù)、基因沉默和染色質(zhì)調(diào)節(jié)等，發(fā)揮著重要作用。將甲基基團(tuán)加入到CpG二核苷酸上的5’位的胞嘧啶（cytosine）上，成為5’甲基胞嘧啶（5’-methylcytosine），是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的一種重要的表觀遺傳修飾，與胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生和遺傳疾病有關(guān)。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase；DNMT）催化這一甲基修飾的維持和發(fā)生。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶分為三種：DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。DNMT1作用于維持甲基化狀態(tài)，而DNMT3在于建立新的甲基化（de novo methylation）�；�于普魯卡因胺（procainamide），一種非核苷酸類抑制劑，特異性抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1活性，以及曲古霉素A（trichostatin A；TSA），一種抗真菌類抗生素，特異性抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B活性的特征，參與其反應(yīng)體系，即S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine；SAM），又稱為AdoMet，作為最常用的甲基直接供給體，通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶把甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到人工合成甲基受體底物分子poly[d（I-C） d（I-C）]上，而生成S腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine；AdoHcy），進(jìn)而快速被腺苷同型半胱氨酸核苷酶（AdoHcy nucleosidase）分解為S-核糖同型半胱氨酸（S-ribosylhomocysteine）和腺嘌呤（adenine），避免了前者累積后負(fù)反饋抑制甲基化過程。腺嘌呤由腺嘌呤脫氨酶（Adenine deaminase）產(chǎn)生次黃嘌呤，通過黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase）催化，生成過氧化氫，然后借助過氧化酶（peroxidase）的作用，與對(duì)羥基苯甲酸（p-hydroxybenzoic acid）和氨基安替比林（4-aminoantipyrine）反應(yīng)，形成有色醌亞胺（quinoneimine），通過其吸收峰值的變化（510nm波長(zhǎng)），來定量分析DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A的活性。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A反應(yīng)系統(tǒng)為：

DNA methyltransferase 3A

poly[d（I-C） d（I-C）] + AdoMet  →  methyl poly[d（I-C） d（I-C）]  + S-adenosylhomocysteine

 

                                AdoHcy nucleosidase

S-adenosylhomocysteine    →   adenine  +  S-ribosylhomocysteine

 

Adenine deaminase

adenine  → hypoxanthine

 

xanthine oxidase

hypoxanthine  +  2H2O  +  O2  →   urate  +  2H2O2 

                            peroxidase

 2H2O2  +  p-hydroxybenzoic acid  +  4-aminoantipyrine  →   quinoneimine  +  4H2O

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

緩沖液（Reagent A）   3毫升

底物液（Reagent B）      250微升

反應(yīng)液（Reagent C）      250微升

陰性液（Reagent D）   250微升

專性液（Reagent E） 250微升

產(chǎn)品說明書      1份

 

保存方式

 

保存在－20℃冰箱里；底物液（Reagent B）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

100微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

• 測(cè)定準(zhǔn)備

 

• 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)510nm，間隔5分鐘，讀數(shù)3次（共15分鐘），并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底物液（Reagent B）避免光照；緩沖液（Reagent A）置于室溫下均衡溫度

 

• 背景對(duì)照測(cè)定

 

• 移取90微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入10微升專性液（Reagent E）
• 加入10微升底物液（Reagent B）
• 加入10微升反應(yīng)液（Reagent C）
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入5微升陰性液（Reagent D） 
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照（15分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

 

• 樣品活性測(cè)定

 

• 移取90微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入10微升專性液（Reagent E）
• 加入10微升底物液（Reagent B）
• 加入10微升反應(yīng)液（Reagent C）
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入5微升待測(cè)樣品（20微克核蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（15分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)） 

 

四、計(jì)算樣品活性 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.125（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 6.58（毫摩爾吸光系數(shù)）X 15（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾S-腺苷甲硫氨酸 /分鐘

 

• 酶標(biāo)儀測(cè)定

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取90微升緩沖液（Reagent A）到96孔板里
• 分別加入10微升專性液（Reagent E） 
• 分別加入10微升底物液（Reagent B）
• 分別加入10微升反應(yīng)液（Reagent C）
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入5微升陰性液（Reagent D）或待測(cè)樣品（20微克核蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和15分鐘讀數(shù)
• 活性計(jì)算：

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.125（毫升，測(cè)定容量）]÷[0.005（樣品容量，毫升）X 6.58（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（光徑距離；厘米）X 15（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾S-腺苷甲硫氨酸/分鐘

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測(cè)定只需1次
• 建議使用純化細(xì)胞核裂解懸液（20微克核蛋白）作為待測(cè)樣品
• 樣品中避免使用DTT、巰基乙醇、TCEP、EDTA等
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 加樣后3秒內(nèi)比色測(cè)定
• 測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定可持續(xù)15分鐘
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測(cè)定15分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為20微克/5微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A單位活性定義為：在37℃，pH 8.0條件下，每分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)移1微摩爾S-腺苷甲硫氨酸甲基所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列甲基化檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感