逆轉(zhuǎn)錄PCR兩步法（RT-PCR）試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

逆轉(zhuǎn)錄PCR兩步法（RT-PCR）試劑是一種旨在通過逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）的作用把RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，采用體外擴(kuò)增DNA的方法（PCR法），進(jìn)行分析RNA構(gòu)造的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于RNA分析、cDNA克隆、RNA表達(dá)等。尤其可用于低拷貝量的RNA樣品。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，嚴(yán)格無核酶污染，操作簡(jiǎn)便，逆轉(zhuǎn)錄效率和擴(kuò)增產(chǎn)量皆高，重復(fù)性好。

技術(shù)背景

單鏈DNA結(jié)合蛋白（Single-Stranded DNA Binding Protein；SSB）用于改善逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）的反應(yīng)產(chǎn)物和作用效率。超能逆轉(zhuǎn)錄酶（Super reverse transcriptase）是一種DNA聚合酶，用于合成以單鏈RNA為模板的配對(duì)性DNA，并能最大限度地增加第一條鏈的cDNA的產(chǎn)量。RNA核酸酶抑制劑（RNAsin）具有廣譜穩(wěn)定的RNA酶抑制功能，用于高質(zhì)量清除RNA酶污染。  

產(chǎn)品內(nèi)容

引導(dǎo)液（Reagent A）    90微升

逆轉(zhuǎn)液（Reagent B） 162微升

反應(yīng)液（Reagent C） 600微升

補(bǔ)充液（Reagent D）      2毫升

產(chǎn)品說明書   1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶自備

RNA樣品：用于逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增的模板

PCR引物：用于逆轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)DNA片段

干式恒溫儀：用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的孵育

0.5毫升PCR管：用于逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)的容器

渦旋震蕩儀：用于反應(yīng)物混勻

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

PCR擴(kuò)增儀：用于核酸產(chǎn)物擴(kuò)增

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的引導(dǎo)液（Reagent A）、逆轉(zhuǎn)液（Reagent B）、反應(yīng)液（Reagent C）和補(bǔ)充液（Reagent D），以及用戶自備的RNA樣品和引物置入冰槽里融化；同時(shí)將干式恒溫儀分別設(shè)置到70℃和37℃。然后進(jìn)行下列操作。

第一步：cDNA合成

• 分別將融化的試劑盒里的試劑溶液渦旋震蕩2秒
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)瞬時(shí)離心5秒
• 移出4.5微升引導(dǎo)液（Reagent A）到新的0.5毫升PCR管
• 加入8微升用戶自備的RNA樣品（5微克總RNA或0.25微克POLY A+ RNA）
• 用槍頭混勻
• 放進(jìn)70℃干式恒溫儀孵育3分鐘
• 即刻放進(jìn)冰槽里
• 加入8微升逆轉(zhuǎn)液（Reagent B）
• 用槍頭混勻
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)瞬時(shí)離心5秒
• 放進(jìn)37℃干式恒溫儀孵育60分鐘
• 即刻放進(jìn)冰槽里
• 加入80微升補(bǔ)充液（Reagent D）稀釋，混勻
• 置入冰槽里備用或放進(jìn)－20℃冰箱里保存

第二步：cDNA擴(kuò)增

• 移出30微升反應(yīng)液（Reagent C）到新的0.5毫升PCR管
• 加入用戶自備的引物F和R（分別總量為350納克）
• 加入2微升上述稀釋的cDNA合成物
• 最后加入補(bǔ)充液（Reagent D）到總量50微升，混勻
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)瞬時(shí)離心5秒
• 使用1000微升槍頭加入2滴礦物油（注意：參見注意事項(xiàng)6）
• 放進(jìn)PCR擴(kuò)增儀，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?

• PCR產(chǎn)物置于－20℃冰箱里保存，直到進(jìn)行任何后續(xù)實(shí)驗(yàn)
• 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 整個(gè)操作須在4℃狀態(tài)下進(jìn)行
• 避免反復(fù)凍融
• 整個(gè)操作須戴手套，建議使用濾芯槍頭，并格外小心，防止降解RNA
• 建議所有的操作用品屬于RNA專用
• 建議使用5微克總RNA樣品量；為了確保獲得滿意效果，不要低于500納克
• 根據(jù)用戶PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）
• 根據(jù)Tm=4（G+C）+2（A+T）公式確定Tm溫度；建議使用分析軟件
• 本公司提供系列RT－PCR產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定嚴(yán)格無核酶污染
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定反應(yīng)產(chǎn)量高