接著上期，我們繼續(xù)回到故事里面。

關(guān)于Mullis發(fā)現(xiàn)PCR的過程，比較公認的版本是，有一天他駕車開過蜿蜒山路的時候，開始琢磨他的檢測單堿基突變的方法。這一次他想到的點子是，既然結(jié)合一條引物是可行的，為什么不試試看同時結(jié)合兩條引物呢。于是Mullis開始在腦海里模擬這個實驗：設(shè)計兩條引物，分別結(jié)合在DNA的正義鏈和反義鏈上，且這兩條引物的3’端均位于待測堿基的上游1個堿基的位置。這樣，當(dāng)進行Oligomer Restriction檢驗的時候，兩條鏈上都會延伸結(jié)合上相應(yīng)的ddNTP。只需要在原先設(shè)計引物的時候?qū)�兩個引物的長度設(shè)計得不一樣，得到的兩個產(chǎn)物就能夠在DNA膠上被區(qū)分開來。這樣，一次檢測就能同時得到兩個結(jié)果，這兩個結(jié)果可以互為對照組，如果兩條鏈的結(jié)果得到的堿基可以互相配對成功，那么證明實驗體系沒有問題，結(jié)果可信；反之，如果兩條鏈結(jié)果不一致，那么很有可能是實驗過程中出現(xiàn)了問題。

Mullis開始模擬實驗：如果混入了dNTP，那么聚合酶在延伸DNA鏈時則會有時用dNTP有時用ddNTP，使得ddNTP結(jié)合的位置就變得不確定，通過他的對照組的設(shè)計就能夠檢測出來，該組實驗結(jié)果不能采信。很好，對照組的效果不錯。那么，有沒有什么辦法可以避免dNTP的混入呢？比如用堿性磷酸酶（BAP,Bacteria Alkaline Phosphate）呢？用BAP除去原有混合物里面的磷酸基團，隨后再加入ddNTP開始反應(yīng)，這樣應(yīng)該不錯。不過得想個辦法在加入ddNTP之前除去BAP的活性。

由于一時想不到好的解決辦法，于是Mullis便開始想，那么就先這樣吧，讓那些混入的dNTP先留 在反應(yīng)體系里面，看看會發(fā)生什么事。于是，在那條漫長的公路上，他又開始繼續(xù)他的思維模擬實驗。這一次，他碰到了真理——PCR。當(dāng)Mullis繼續(xù)想著他的模擬實驗的時候，他距離真理已經(jīng)越來越近了。如果原先的反應(yīng)體系里面混有dNTP，那么不妨先加入DNA聚合酶讓反應(yīng)發(fā)生，這時dNTP就會被作為原料完成DNA復(fù)制的反應(yīng)；而此時只需要加熱使DNA雙鏈變性，再冷卻復(fù)性時由于引物的量很多，因此原來的DNA鏈與引物結(jié)合的可能性最大，這樣就達到了去除dNTP的目的。但是，如果dNTP的量比較多，延伸得比較長，使得變性復(fù)性之后，新合成的鏈與下游的反向引物結(jié)合了呢？  

EUREKA（找到了）！這樣也沒有關(guān)系，不就是模板鏈加倍了嗎！單堿基突變檢測照常進行！那么我可以有意多加引物保證模板鏈復(fù)制以提高效率！如果像這樣一遍一遍重復(fù)，那么模板DNA就可以不斷復(fù)制擴增了！單堿基檢測的效率就大大提高了！

于是Mullis開始給Cetus其他的科學(xué)家們講他的想法，但是除了他的女友Jennifer以及為數(shù)不多的幾個技術(shù)員之外，其余的人都對他的想法并不感興趣。不過同時，他的同事們也并不能從他的設(shè)計里面挑出任何漏洞。也就意味著，很有可能方案可行。

接下來就是實驗驗證了，在實驗中他也經(jīng)歷了一些挫折。終于在1984年Mullis和Cetus公司對于PCR技術(shù)申請了技術(shù)專利，并且撰寫了文章發(fā)表。由公司撰寫的關(guān)于PCR技術(shù)應(yīng)用的文章很快在Science上刊發(fā)，但是由于種種原因，Mullis撰寫的PCR原理的文章先后被nature和Science拒絕，最后只能發(fā)表在不知名的Methods of Enzymology （《酶學(xué)方法》）雜志上（真是天大的遺憾啊，估計此時nature和Science腸子都悔青了�。�。

寫到最后，回顧PCR發(fā)明的科學(xué)歷程，還是非常有趣的。通常我們研究一個科學(xué)問題的思路，是提出一個重大的科學(xué)問題（Question），找到一個適合的研究體系（System），并借助于相關(guān)的技術(shù)（Technique）進行實驗探索與猜想驗證。如果不是這個思維極度發(fā)散，同時又善于抓住重要問題的“科學(xué)怪才”，即便是好點子送上們來也只怕會擦肩而過了。