植物生長離不開各種的金屬與非金屬元素。這些元素通過土壤、大氣、水進(jìn)入植物體內(nèi)，通過植物體內(nèi)的運(yùn)輸和一系列生理生化反應(yīng)分布到植物的各個(gè)部位。各種元素對植物的影響一直是植物研究的重要熱點(diǎn)之一。這項(xiàng)研究的焦點(diǎn)主要集中在兩個(gè)方面：1. 由于日趨嚴(yán)重的糧食安全問題，如何獲得最優(yōu)化的施肥方法既可以提高作物產(chǎn)量和質(zhì)量，又能減少對環(huán)境造成的可能傷害（富營養(yǎng)化等）是擺在全人類面前的重大課題；2. 現(xiàn)代工業(yè)造成環(huán)境中嚴(yán)重的重金屬污染，這些重金屬通過植物富集并傳導(dǎo)到動物圈和人類。為了搞清楚這兩個(gè)問題的運(yùn)行規(guī)律并找到解決方案，就必須對植物在不同元素條件的生理生態(tài)反應(yīng)進(jìn)行研究。

    
    圖1. 礦物質(zhì)和水分在植物體內(nèi)的運(yùn)輸過程（https://online.science.psu.edu/）

很多傳統(tǒng)的植物生理生化指標(biāo)和元素分析方法大都需要將樣品取回實(shí)驗(yàn)室，并進(jìn)行破壞性預(yù)處理。這一過程中很多重要的信息都可能缺失或者產(chǎn)生變化，而且不能做到對同一個(gè)樣品進(jìn)行長期監(jiān)測，難以估量植物不同生長期的差異變化。本文將介紹一些國際上最先進(jìn)的用于植物原位養(yǎng)分利用與重金屬毒害研究的無損/準(zhǔn)無損儀器技術(shù)。

一、葉綠素?zé)晒?葉綠素?zé)晒獬上穹治黾夹g(shù)

葉綠素?zé)晒鈩討B(tài)分析技術(shù)是目前最快捷無損的監(jiān)測植物生物與非生物脅迫下光合性能的技術(shù)，也是用于植物生理學(xué)和生態(tài)生理學(xué)研究的最有效的、最權(quán)威的和應(yīng)用最廣的技術(shù)之一（Lu，2001；Lu，1999）。因此在葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)剛剛發(fā)展成熟之初，這項(xiàng)技術(shù)就被用于植物養(yǎng)分和金屬脅迫研究。1985年Sivak發(fā)現(xiàn)N、P、K、Mn、Fe、S或Cu缺乏的甜菜，葉綠素?zé)晒馇�線與對照組產(chǎn)生了偏離（Sivak, 1985）。Abadia在1988年就提出了用葉綠素?zé)晒鉁y量的方法來快速簡便地檢測植物營養(yǎng)缺失（Abadia，1988）。

 圖2. 大麥Mn缺乏與Mn充足造成OJIP快速瞬變熒光動力學(xué)曲線變化（Hebbern, 2005）

但是傳統(tǒng)的葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)也有其局限性。一般的葉綠素?zé)晒鈨x僅能通過光纖測量一個(gè)點(diǎn)的總值。無法展示樣品不同部位、結(jié)構(gòu)的差異，更難以研究脅迫受損組織的分布以及受損部分和健康部分的差異，測量的數(shù)據(jù)無法代表測量樣品的全部情況。隨著Charge-CoupledDevice(CCD)相機(jī)技術(shù)、電腦圖像分析技術(shù)以及LED光源板技術(shù)的成熟，從上世紀(jì)八十年代末開始，葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)開始逐漸發(fā)展起來。Ladislav Nedbal等于上世紀(jì)90年代末期發(fā)明了與PAM技術(shù)相結(jié)合的葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)，研制成功了第一臺FluorCam調(diào)制式葉綠素?zé)晒獬上駜x（Nedbal，2000），使得葉綠素?zé)晒庋芯空�式進(jìn)入二維時(shí)代。這一技術(shù)發(fā)明以后，就因?yàn)槠淇梢灾庇^定量反映營養(yǎng)元素與重金屬對植物光合系統(tǒng)產(chǎn)生影響的部位、分布、面積及具體機(jī)理，而迅速取代傳統(tǒng)的葉綠素?zé)晒鈨x。

  
    圖3. 最初的FluorCam調(diào)制式葉綠素?zé)晒獬上駜x設(shè)計(jì)圖與熒光成像圖（Nedbal，2000）

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)使用FluorCam研究了兩種玉米在不同施氮條件下光合特性的變化（Li, 2012）。研究發(fā)現(xiàn)，施加氮肥使兩個(gè)品種的最大光化學(xué)效率Fv/Fm和量子產(chǎn)額ΦPSII都有所升高，而ΦPSII的升高幅度要高于Fv/Fm，表明氮肥對PSII的實(shí)際功能活性更有作用。同時(shí)玉米品種HZ4熒光參數(shù)的升高幅度也要高于Q319，這應(yīng)該是由于HZ4是一種低N效率的非持綠玉米。

Vaculík研究了硅元素對緩解玉米鎘毒害的作用。通過檢測玉米葉片的實(shí)際量子產(chǎn)額ΦPSII發(fā)現(xiàn)：在低濃度鎘處理下，添加硅元素幾乎可以消除鎘的毒害；在高濃度處理下，添加硅元素不但減輕了鎘毒害的程度，同時(shí)也使毒害面積大為減少（Vaculík，2015）。

FluorCam葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)也用于大氣重金屬等污染監(jiān)測研究。Hida通過對監(jiān)測鋼鐵廠不同距離白楊葉片的相對熒光衰減指數(shù)Rfd，發(fā)現(xiàn)了空氣污染影響植物光合系統(tǒng)的規(guī)律與季節(jié)波動，也為監(jiān)測空氣污染找到了靈敏直觀的生物指標(biāo)（Hida, 2014）。

              圖7. FluorCam系列葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)

二、多光譜熒光動態(tài)顯微成像技術(shù)（Fluorescence Kinetic Microscope）
FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的出現(xiàn)解決了研究各種脅迫因素對植物宏觀光合表型的問題。但對于微觀層次，每個(gè)細(xì)胞乃至葉綠體的光合表型研究還是無能為力。就在Nedbal開發(fā)FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的同時(shí)，他就與德國康斯坦丁大學(xué)教授Küpper、捷克科學(xué)院Martin Trtilek（Photon Systems Instruments公司總裁，Nedbal為Photon Systems Instruments公司首席科學(xué)家）共同開發(fā)了而用于微觀熒光成像的Fluorescence kinetic microscopy（FKM）熒光動力學(xué)顯微成像技術(shù)（Küpper，2000）。從此葉綠素?zé)晒鈩恿�學(xué)研究才能夠研究各種不同尺度的樣品，比如葉綠體、細(xì)胞、植物組織、器官乃至整個(gè)植物個(gè)體。之后，F(xiàn)KM技術(shù)被廣泛用于藻類的葉綠素?zé)晒庋芯俊?/P>

2007 年，Küpper 繼續(xù)與 Martin Trtilek和 PSI 公司合作開發(fā)了新版本的FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)（Küpper，2007）。新型的FKM增加了如下幾種主要功能：1.能夠?qū)�熒光成像圖中選定部位進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈩恿�學(xué)分析，這樣就能直接對比分析植物健康部位和受損部位的差別；2.具備多種不同光質(zhì)（紅光、藍(lán)光、白光、綠光、UV紫外光、遠(yuǎn)紅光等）的激發(fā)光源，可以研究各種不同天線色素的葉綠素?zé)晒鈩恿�學(xué)和其他非葉綠素?zé)晒鈩恿�學(xué)；3.配備光譜儀，可以直接研究激發(fā)的各種熒光的光譜變化。同時(shí)，Küpper將FKM和FluorCam結(jié)合使用，將FKM的應(yīng)用從單純的藻類擴(kuò)展到對高等植物葉綠體的活體原位研究，尤其是重金屬對植物微觀光合結(jié)構(gòu)的毒害效應(yīng)。

       
圖8. 上圖：FKM初期設(shè)計(jì)及其藻類葉綠素?zé)晒獬上駡D；
下圖：FKM最新設(shè)計(jì)及其鎘脅迫處理天藍(lán)遏藍(lán)菜Thlaspi caerulescens顯微結(jié)構(gòu)葉綠素?zé)晒獬上駡D

正是由于FKM技術(shù)提供了這樣強(qiáng)大的研究工具，之后很多科學(xué)家相繼使用FKM技術(shù)研究了海州香薷Elsholtzia splendens、沼澤景天Crassula helmsii、Haumaniastrum katangense、天藍(lán)遏藍(lán)菜Thlaspi caerulescens等植物和束毛藻Trichodesmium、金魚藻Ceratophyllum demersum、米氏凱倫藻Karenia mikimotoi等藻類的Fe、Cu、Ni、Zn、Cd微觀毒害與調(diào)控機(jī)制，以及藻類的固氮作用與由于富營養(yǎng)化造成水華的發(fā)生機(jī)理（Higo, 2017；Andresen，2016； Peng，2013；Peng，2012；Leitenmaier，2011；Küpper，2009）。

  
圖9. 束毛藻Trichodesmium的熒光動態(tài)顯微（FKM）成像圖（Küpper，2008）

三、多光譜/高光譜成像技術(shù)
植物由于在可見光-近紅外波段具備獨(dú)特的反射光譜特征曲線。因此通過特定波段反射率計(jì)算的各種植被指數(shù)就可以反應(yīng)植物相應(yīng)的生理特征。

   
              圖10. 植物的反射光譜及不同波段的意義

常用的植被指數(shù)有歸一化植被指數(shù)NDVI、光化學(xué)植被反射指數(shù)PRI、歸一化葉綠素指數(shù)NPCI、簡單比值指數(shù)SR、改進(jìn)的葉綠素吸收反射指數(shù)MCARI、最優(yōu)化土壤調(diào)整植被指數(shù)OSAVI、綠度指數(shù)G、轉(zhuǎn)換類胡羅卜素指數(shù)TCARI、三角植被指數(shù)TVI等。而這其中最為常用的就是歸一化植被指數(shù)NDVI，其計(jì)算公式為：

這一指數(shù)反映了植物葉綠素在紅光波段的高吸收和近紅外波段的高反射，與植物的葉綠素濃度密切相關(guān)，進(jìn)而可以反推出植物氮含量（Maarschalkerweerd，2015）。

FluorCam葉綠素?zé)晒庀到y(tǒng)本身即具備NDVI成像測量功能，可以完成葉綠素?zé)晒馀cNDVI成像的同步測量。

 
   圖11. 使用FluorCam成像系統(tǒng)測量的珊瑚與藻類共生體的NDVI成像（Leal，2015）

而為了滿足現(xiàn)代植物表型組學(xué)研究的需要，PSI公司在FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的基礎(chǔ)上，整合了LED植物智能培養(yǎng)、自動化控制系統(tǒng)、植物熱成像分析、植物近紅外成像分析、植物高光譜分析、自動條碼識別管理、RGB真彩3D成像、自動稱重與澆灌系統(tǒng)等多項(xiàng)先進(jìn)技術(shù)建立了PlantScreen植物表型成像系統(tǒng)，以最優(yōu)化的方式實(shí)現(xiàn)大量植物樣品——從擬南芥、玉米到各種其它植物的全方位生理生態(tài)與形態(tài)結(jié)構(gòu)成像分析，是目前植物表型組學(xué)包括養(yǎng)分元素與重金屬脅迫研究最全面的儀器系統(tǒng)。

       
       圖12. PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)及其各個(gè)功能模塊

如果需要在更大尺度上進(jìn)行多光譜/高光譜成像分析，目前最為適合的就是無人機(jī)遙感技術(shù)。無人機(jī)遙感技術(shù)是無人機(jī)技術(shù)與遙感成像分析技術(shù)等高新技術(shù)的創(chuàng)新性集成系統(tǒng)平臺，使植物表型分析真正從實(shí)驗(yàn)室走向大田野外、從單個(gè)葉片或單株植物或幾十平方米的視野一下子躍升到幾百畝或者上千畝甚至更大范圍、從每天幾千株植物的高通量躍升到幾百萬幾千萬甚至更多的超高通量測量分析。

International Maize and Wheat Improvement Center利用無人機(jī)表型分析技術(shù)，對大田玉米貧氮脅迫抗性進(jìn)行了研究分析，研究結(jié)果參見下列圖表： 

   
圖13. 不同梯度氮脅迫（左圖中ss指高度氮脅迫、ms為中度氮脅迫、c為正常施肥）及根據(jù)NDVI得出的氮脅迫指數(shù)。

UAS-4四旋翼專業(yè)表型分析無人機(jī)平臺或UAS-8八旋翼專業(yè)表型分析無人機(jī)平臺配置高清晰RGB鏡頭、多光譜鏡頭、高光譜鏡頭、紅外熱成像鏡頭及LiDAR等傳感器，及相應(yīng)數(shù)據(jù)處理分析軟件組成。多年與PSI植物表型分析研究中心合作，積多年植物／作物表型分析技術(shù)服務(wù)經(jīng)驗(yàn)，為植物表型分析提供全面技術(shù)方案；PhenoUAS可測量分析植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)性狀如葉面積、覆蓋度、株高、冠幅等等，還可測量分析植物的功能性狀如長勢、抗性、脅迫（包括生物脅迫與非生物脅迫）、產(chǎn)量評估等。

圖14. 左：PhenoUAS-8八旋翼無人機(jī)植物表型分析平臺在陜西楊凌飛行作業(yè)示范；右上：西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥田NDVI遙測成像圖；右下：陜西佛坪大熊貓保護(hù)區(qū)植被分類遙測圖，粉色-松樹，綠色-竹子，黃色-裸地道路，藍(lán)色-雪

四、激光誘導(dǎo)擊穿光譜分析技術(shù)Laser-Induced BreakdownSpectroscopy（LIBS）
葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)、多光譜/高光譜成像分析技術(shù)雖然可以最優(yōu)化地測量植物對元素和重金屬的生理生態(tài)反應(yīng)，但畢竟不能直接測量元素和重金屬在植物體的具體含量和分布情況。

但是，傳統(tǒng)的植物元素測量方法比如比色法colorimetry、光譜測定法spectrometry、高溫堿溶high temperature alkaline dissolution和電熱氣化electro-thermal vaporization 配合上電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy (ICP-AES)、離子淌度譜法ion mobility spectrometry (IMS) 和石墨爐原子吸收光譜法graphite furnace atomic absorption spectrometry (GFAAS)等。

這些技術(shù)用于植物元素分析還是有很多問題。比如樣品需要消解、樣品的預(yù)處理需要消耗昂貴的化學(xué)藥品并耗費(fèi)大量時(shí)間、由此還會導(dǎo)致環(huán)境的潛在破壞（Tripathi，2015）。而這些技術(shù)更大的局限性是難以表現(xiàn)植物元素的差異性分布，同時(shí)又因?yàn)楸仨殞�樣品進(jìn)行破壞性預(yù)處理而不能做到無損/準(zhǔn)無損原位測量和長期監(jiān)測。

激光誘導(dǎo)擊穿光譜分析技術(shù)Laser-Induced Breakdown Spectroscopy（LIBS）的逐漸成熟解決了這一問題。該技術(shù)通過超短脈沖激光聚焦樣品表面形成等離子體，利用光譜儀對等離子體發(fā)射光譜進(jìn)行分析，以此來識別樣品中的元素組成成分。該技術(shù)的特點(diǎn)有：
1.快速直接分析，幾乎不需要樣品制備
2.可進(jìn)行準(zhǔn)無損測量
3. 可進(jìn)行元素分布二維制圖
4.可進(jìn)行遠(yuǎn)距離遙測
5.可檢測幾乎所有元素
6.可同時(shí)分析多種元素
7.基體形態(tài)多樣性 - 可以檢測幾乎所有固態(tài)樣品，乃至液體、氣體樣品
8.精度最高可達(dá)到ppm級

  
    圖15. 左：Sci-Trace LIBS元素分析系統(tǒng)；右：X-Trace LIBS元素遙測分析系統(tǒng)

這一技術(shù)最初主要用于材料、冶金、地質(zhì)、礦物等研究。CEITEC歐洲工程技術(shù)中心AtomTrace LIBS研究團(tuán)隊(duì)可以說是最早關(guān)注到LIBS技術(shù)在生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的科研團(tuán)隊(duì)之一。2005年，Jozef Kaiser博士（Atomtrace科學(xué)主任、布爾諾大學(xué)教授、激光光譜學(xué)研究室負(fù)責(zé)人、CEITEC物質(zhì)特性與表面科學(xué)研究部主任）等在European Physical Journal上發(fā)表了“Mapping of the metal intake in plants by large-field X-ray microradiography and preliminary feasibility studies in microtomography”(Eur.Phys.J. D 32, 113-118)；2006年又利用LIBS飛秒激光光譜分析技術(shù)研究分析了植物樣品鐵、錳元素的分布并首次作出完整葉片鐵元素的二維分布圖，并發(fā)表了“Femtosecond laser spectrochemical analysis of plant samples”（Laser Phys.Lett.3, No.1, 21-25, 2006）。

2007年至2010年，以Kaiser博士為代表的研究團(tuán)隊(duì)利用μCT與飛秒激光誘導(dǎo)擊穿光譜技術(shù)（LIBS）及LA-LCP-MS等技術(shù)，對向日葵等植物組織中重金屬元素吸收積累進(jìn)行了研究分析，先后發(fā)表論文：
1)Monitoring of the heavy-metal hyperaccumulation in vegetal tissues by X-ray radiography and by Femto-second laser induced breakdown spectroscopy. Microscopy research and technique 70:147-153, 2007；
2)Utilization of laser induced breakdown spectroscopy for investigation of the metal accumulation in vegetal tissues. SpectrochimicaActa Part B 62:1597-1605；
3)Investigation of heavy-metal accumulation in selected plant samples using laser induced breakdown spectroscopy and laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry. Appl. Phys. A 93:917-922, 2008；
4)Multi-instrumental analysis of tissues of Sunflower plants treated with Silver(I) ions—plants as bioindicators of environmental pollution
5)Mapping of lead, magnesium and copper accumulation in plant tissues by laser-induced breakdown spectroscopy and laser-ablation inductively coupled plasma mass spectrometry. SpectrochimicaActa Part B 64:67-73, 2009;
6)Sunflower plants as bioindicators of environmental pollution with lead(II) ions. Sensors 9:5040-5058, 2009；
7)Detection of lead in Zea mays by dual-energy X-ray Microtomography at the SYRMEP Beamline of the ELETTRA Synchrotron and by Atomic Absorption Spectroscopy. Microscopy Research and Technique 73:638-649, 2010;
8)Determination of plant thiols by liquid Chromatography Coupled with Coulometric and Amperometric Detection in Lettuce treated by lead(II) ions. Electroanalysis 22 No.11:1248-1259, 2010

在這些研究中，CEITEC/Atomtrace LIBS研究團(tuán)隊(duì)不僅最早利用LIBS技術(shù)作出完整葉片元素分布圖，還最早利用LIBS技術(shù)與顯微CT（μCT）相結(jié)合進(jìn)行三維化學(xué)成像構(gòu)建，同時(shí)還開展了小鼠腎臟、蛇骨、古生物牙齒等動物樣品的LIBS元素分析研究。

2012年，Kaiser博士等根據(jù)多年的研究成果和同行研究情況，撰寫發(fā)表了綜述性文章“Trace elemental analysis by Laser-induced breakdown spectroscopy---biological applications”(Surface Science Report 67:233-243, 2012)。上述研究成果奠定了以Kaiser博士等為代表的激光光譜學(xué)實(shí)驗(yàn)室LIBS技術(shù)在全球生命與環(huán)境科學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域的領(lǐng)先地位。

在研究植物養(yǎng)分利用與重金屬毒害時(shí)，LIBS技術(shù)經(jīng)常會與葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)聯(lián)合應(yīng)用。2012年，CEITEC激光光譜學(xué)實(shí)驗(yàn)室研究團(tuán)隊(duì)與PSI公司合作，在《SpectrochimicaActa Part B》發(fā)表了“Application of laser-induced breakdown spectroscopy to the analysis of algal biomass for induxrial biotechnology”,該研究利用LIBS技術(shù)和特制液體樣品激光作用室，分析了藻類培養(yǎng)液與生物膜中鉀、鎂、鈣、鈉等與藻類至關(guān)重要的元素及銅等毒性重金屬元素積累。

印度阿拉哈巴德大學(xué)則通過FP100葉綠素?zé)晒鈨x（FluorCam的非成像版）和LIBS技術(shù)結(jié)合，研究了小麥經(jīng)過重金屬處理，植物體內(nèi)元素含量變化與葉綠素?zé)晒夤夂咸匦缘年P(guān)系。研究成果連續(xù)發(fā)表了多篇文獻(xiàn)（Tripathi，2016；Tripathi，2015）

  
      圖18. 左：LIBS藻類測量方案；右：藻類生物膜脈沖激光剝蝕孔

關(guān)于本文涉及到的儀器技術(shù)詳細(xì)信息請?jiān)L問北京易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司官網(wǎng)，或者與我們聯(lián)系獲取技術(shù)快訊與文獻(xiàn)原文。

易科泰生態(tài)技術(shù)致力于引進(jìn)、消化、吸收和創(chuàng)新國際先進(jìn)生物生態(tài)科研技術(shù)，提供植物表型分析、作物脅迫敏感性與抗性檢測、光養(yǎng)生物反應(yīng)器／藻類培養(yǎng)與在線監(jiān)測、生態(tài)毒理學(xué)檢測技術(shù)方案和實(shí)驗(yàn)服務(wù)與合作。旗下的Ecolab實(shí)驗(yàn)室目前配備有FluorCam封閉式熒光成像系統(tǒng)、FluorCam封閉式熒光成像系統(tǒng)、FluorCam便攜式熒光成像儀、FL3500葉綠素?zé)晒鈨x、FluorPen手持式葉綠素?zé)晒鈨x、AquaPen藻類熒光儀、PolyPen手持式植物光譜測量儀、SpectraPen LM500手持式光譜儀、PlantPen手持式光譜儀、FMT150藻類培養(yǎng)與在線監(jiān)測系統(tǒng)、MC1000 8通道藻類培養(yǎng)與在線監(jiān)測系統(tǒng)、MicroMac1000全自動營養(yǎng)鹽分析監(jiān)測系統(tǒng)、FMS CO2/O2呼吸測量分析系統(tǒng)等，并與中科院植物所、中科院水生所、中國農(nóng)科院、陜西師范大學(xué)等建立了長期技術(shù)合作交流關(guān)系。歡迎聯(lián)系開展實(shí)驗(yàn)合作與技術(shù)培訓(xùn)。郵箱：eco-lab@eco-tech.com.cn，info@eco-lab.cn; 電話：010-62615899

參考文獻(xiàn)：
1.Lu, C.M., Zhang, J.H., Zhang, Q.D., Li, L.B., Kuang, T.Y., 2001. Modification of photosystem II photochemistry in nitrogen deficient maize and wheat plants. J. Plant Physiol. 158, 1423–1430.
2.Lu, C.M., Zhang, J.H., 1999. Effects of water stress on photosystem II photochemistry and its thermostability in wheat plant. J. Exp. Bot. 50, 1199–1206.
3.Sivak, M. N., Dietz, K. J., Heber, U., and Walker, D. A. (1985). The relationship between light-scattering and chlorophyll a fluorescence during oscillations in photosynthetic carbon assimilation. Arch. Biochem. Biophys. 237, 513–519
4.Abadia, J., Rao, I. M., and Terry, N. (1988). Light scattering in vivo as a tool for mineral nutrient deficiency diagnosis in crop plants. J. Plant Nutr. 11, 423–434.
5.    Hebbern, C. A., Pedas, P., Schjoerring, J. K., Knudsen, L., and Husted, S. (2005). Genotypic differences in manganese efficiency: Field experiments with winter barley (Hordeum vulgare L.). Plant Soil 272, 233–243
6.Nedbal L, Soukupová J, Kaftan D, Whitmarsh J & Trtílek M. 2000. Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light. Photosynthesis research 66, 3 – 12
7.Li, G. et al. 2012. Effects of nitrogen on photosynthetic characteristics of leaves from two different stay-green corn (Zea mays L.) varieties at the grain-filling stage. Can. J. Plant Sci. 92, 671-680
8.Vaculík M, et al. 2015. Silicon alleviates cadmium toxicity by enhanced photosynthetic rate and modified bundle sheath's cell chloroplasts ultrastructure in maize. Ecotoxicology and Environmental Safety 120, 66–73
9.Hida, E. et al. 2014. The influence of stress analyzed by the emitted fluorescence changes. IOSR J. Engineering. 4(4), 38-43
10.Küpper H, Setlík I, Trtílek M, Nedbal L. 2000. A microscope for two-dimensional measurements of vivo chlorophyll fluorescence kinetics using pulsed measuring light, continuous actinic light and saturating flashes. Photosynthetica, 38: 553-570
11.Küpper H, et al. 2007. Cadmium-induced inhibition of photosynthesis and long-term acclimation to cadmium stress in the hyperaccumulator Thlaspi caerulescens. New Phytologist, 175: 655-674
12.Higo S, et al. 2017. Application of a pulse-amplitude-modulation (PAM) fluorometer reveals its usefulness and robustness in the prediction of Karenia mikimotoi blooms: A case study in Sasebo Bay, Nagasaki, Japan. Harmful Algae, 61:63-70
13.Andresen E, et al. 2016. Cadmium toxicity investigated at the physiological and biophysical levels under environmentally relevant conditions using the aquatic model plant Ceratophyllum demersum. New Phytol., 210(4):1244-1258
14.Peng H, et al. 2013. Toxicity and Deficiency of Copper in Elsholtzia splendens Affect Photosynthesis Biophysics, Pigments and Metal Accumulation. Environ. Sci. Technol., 47 (12): 6120-6128
15.Peng H, et al. 2012. Differences in copper accumulation and copper stress between eight populations of  Haumaniastrum katangense, Environmental and Experimental Botany, 79: 58- 65
16.Leitenmaier B, et al. 2011. Cadmium uptake and sequestration kinetics in individual leaf cell protoplasts of the Cd/Zn hyperaccumulator Thlaspi caerulescens. Plant, Cell and Environment, 34: 208-219
17.Küpper H, et al. 2009. Complexation and Toxicity of Copper in Higher Plants. I. Characterization of Copper Accumulation, Speciation, and Toxicity in Crassula helmsii as a New Copper Accumulator. Plant Physiology, 151: 702-714
18.Küpper H, et al. 2008. Iron limitation in the marine cyanobacterium Trichodesmium reveals new insights into regulation of photosynthesis and nitrogen fixation. New Phytologist, 179(3): 784-798
19.Maarschalkerweerd M, et al. 2015. Recent developments in fast spectroscopy for plant mineral analysis. Front. Plant Sci. 6:169
20.Leal M C, et al. 2015. Concurrent imaging of chlorophyll fluorescence, Chlorophyll a content and green fluorescent proteins-like proteins of symbiotic cnidarians. Marine Ecology, DOI: 10.1111/maec.12164
21.Tripathi D K, et al. 2015. Silicon-mediated alleviation of Cr(VI) toxicity in wheat seedlings as evidenced by chlorophyll florescence, laser induced breakdown spectroscopy and anatomical changes. Ecotoxicology and Environmental Safety, 113:133-144
22.Tripathi D K, et al. 2016. LIB spectroscopic and biochemical analysis to characterize lead toxicity alleviative nature of silicon in wheat (Triticum aestivum L.) seedlings. Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology 154: 89-98