農(nóng)林RNA測序助力玉米籽粒dek35突變體研究

該研究與前幾天RNA測序在玉米籽粒dek2突變體中分子機制的研究應(yīng)用相似，研究的主角依然是上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，該工作主要由陳鑫澤博士完成。研究對象由dek2突變體變?yōu)榱薲ek35突變體。

研究思路

研究結(jié)果

dek35突變表現(xiàn)出發(fā)育遲緩的表型

本研究中dek35突變來源于美國玉米種質(zhì)中心，編號為5605F。其表現(xiàn)出小籽粒，并且頂部種皮中空（圖1）。突變體百粒重只有野生型20%（dek2是35%）（圖1）�？偟矸邸⒅辨湹矸酆涂們Σ氐鞍缀�量沒有顯著變化，醇溶蛋白在突變體中顯著下降。亞細胞層面觀察發(fā)現(xiàn)，胚乳轉(zhuǎn)移層細胞（BETL）在突變體中發(fā)育遲緩，表明籽粒發(fā)育受到抑制（圖1）。

dek35基因克隆

研究人員對dek35突變體進行圖位克隆，將其定位于玉米1號染色體254,244,136 bp to 289,337,516 bp大約35M區(qū)段內(nèi)。由于該突變來源于Mutator突變系，研究人員懷疑其可能含有Mu的插入（圖2）。對其進行Mu標(biāo)簽分離表明，一個Mu標(biāo)簽存在于35M的區(qū)段內(nèi)，插入在了GRMZM2G066749起始密碼子下游30bp處。該結(jié)果同樣通過等位測試驗證（圖2）。

dek35編碼了一個P-type PPR蛋白

研究人員通過將GRMZM2G066749蛋白編碼序列在數(shù)據(jù)庫中比對后發(fā)現(xiàn)，該基因編碼了一個P-type PPR蛋白（圖2）。

dek35在籽粒發(fā)育過程中持續(xù)性表達

研究人員通過定量PCR以及Western Blot雜交發(fā)現(xiàn)，dek35是一個全組織表達的基因（圖3）。

dek35定位于線粒體中

將dek35連接入熒光表達載體，使其與黃色熒光蛋白YFP融合，并對其共聚焦顯微鏡亞細胞定位研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，dek35定位于線粒體內(nèi)嵴（圖4）。

dek35影響nad4內(nèi)含子1的剪切

由于PPR蛋白可以與對應(yīng)的線粒體或者葉綠體RNA互作，因此研究人員對dek35突變體胚乳以及野生型胚乳的線粒體轉(zhuǎn)錄本進行了分析。研究人員使用特異的引物擴增了線粒體cDNA，在35個基因中，只有nad4的成熟轉(zhuǎn)錄本在dek35中顯著下降（圖5）。進一步研究發(fā)現(xiàn)，nad4內(nèi)含子1在dek35中顯著下降導(dǎo)致了全長成熟轉(zhuǎn)錄本表達量下降。

dek35影響了線粒體復(fù)合物I的聚集

為了深入研究線粒體的呼吸復(fù)合物，研究人員分離了dek35 線粒體蛋白并且進行了非變性的BN-PAGE電泳。電泳結(jié)果顯示，復(fù)合物I含量顯著下降（圖6）。該結(jié)果證明了nad4內(nèi)含子1的剪切影響導(dǎo)致了復(fù)合物I功能的下降（圖7）。

dek35影響了線粒體的正常功能

研究人員為了對dek35在籽粒發(fā)育過程中的作用有全局性的了解，分別選取了的dek35胚乳以及野生型胚乳進行了RNA轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq服務(wù)由伯豪生物提供）。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，一共篩選到了4720個差異基因，其中632個基因具有功能注釋。在GO歸類后，研究人員發(fā)現(xiàn)，這些基因主要聚集于mitochondrial inner membrane (GO:0005743, P-value=2.2E-07), ATP synthesis coupled proton transport (GO:0015986, P-value=0.00043), protein targeting to mitochondrion (GO:0006626, P-value=2.0E-05) and cytochrome-c oxidase activity (GO:0004129, P-value=0.0024) （圖8）。

dek35突變體線粒體形態(tài)變化顯著

為了對dek35突變體線粒體有深入的表型觀察，研究人員最后還通過透射電鏡觀察了突變體與野生型的表型變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體的線粒體呈現(xiàn)畸形的表型（圖9）。

研究結(jié)論

dek35與dek2同樣編碼了一個定位于線粒體的P-type PPR蛋白。dek35突變導(dǎo)致了顯著的該基因蛋白水平的下降，降低了對nad4內(nèi)含子1剪切效率（dek2是降低nad1內(nèi)含子1的剪切效率）。對dek35突變體線粒體復(fù)合物的分析發(fā)現(xiàn)，dek35未成熟籽粒表現(xiàn)出了復(fù)合物I顯著的缺失以及NADH脫氫酶活性顯著下降。對dek35突變體籽粒進行轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，呼吸相關(guān)基因表達量顯著升高，線粒體功能相關(guān)基因表達量變化顯著。該結(jié)果表明dek35突變體是一個新的PPR蛋白影響了線粒體nad4內(nèi)含子1的順勢剪切。并且對籽粒發(fā)育至關(guān)重要。

原文出處：Chen X, Feng F, Qi W, Xu L, Yao D, Wang Q, Song R. Dek35 Encodes a PPR Protein that Affects cis-Splicing of Mitochondrial nad4 Intron 1 and SeedDevelopment in Maize. Mol Plant. 2016.