上期分享的蛋白組學(xué)內(nèi)容，是不是有些小伙伴還繞在云里霧里呀？這次，小編用實例說話，幫您梳理清楚。

一、Label-free定量

  Label-free定量，顧名思義就是不需要對比較樣本做特定標(biāo)記處理，只需要比較特定肽段/蛋白在不同樣品間的色譜質(zhì)譜響應(yīng)信號便可得到樣品間蛋白表達(dá)量的變化，通常用于分析大規(guī)模蛋白鑒定和定量時所產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

  Label-free技術(shù)又可分為基于譜圖數(shù)（Spectra Count，簡稱SC）和基于肽段母離子強度（或色譜離子流的峰面積即XIC）兩種方法，后者更準(zhǔn)確，使用更廣泛。

技術(shù)特點

無需標(biāo)記，操作簡單；

不受比較樣品數(shù)限制；

對實驗操作穩(wěn)定性、重復(fù)性要求高；

準(zhǔn)確性較標(biāo)記定量差；

要求至少做三次技術(shù)重復(fù)或生物重復(fù)。

適用范圍

適合大樣本量的定量比較；

對無法用標(biāo)記定量實現(xiàn)的實驗設(shè)計，易用label-free技術(shù)；

經(jīng)典案例

題目：Label-free global serum proteomic profiling reveals novel celecoxib-modulated proteins in familial adenomatous polyposis patients（利用Label-free定量技術(shù)進(jìn)行家族性腺瘤息肉病患者血清的全蛋白質(zhì)組分析，尋找Celecoxib調(diào)控蛋白）

期刊：Cancer genomics proteomics

主要技術(shù)：Label-free定量

文章摘要：Celecoxib是一種環(huán)氧合酶選擇性抑制劑，能夠?qū)�患有預(yù)防家族性腺瘤性息肉�。‵AP)和散發(fā)性大腸癌的病人進(jìn)行防治。為了識別其具體的作用機制，本文采用多維色譜分離方法結(jié)合電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜，使用Label-free定量技術(shù)，比較經(jīng)Celecoxib處理前、后血清樣品的蛋白質(zhì)組表達(dá)量差異。發(fā)現(xiàn)了83個可能為Celecoxib響應(yīng)的表達(dá)量顯著差異蛋白。通過Western blotting方法，在FAP病人和結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系中進(jìn)一步確認(rèn)了一些Celecoxib調(diào)控蛋白，為進(jìn)一步進(jìn)行Celecoxib作用機制的大規(guī)模臨床試驗奠定了基礎(chǔ)。

圖：Apo A-II蛋白中特征肽的定量結(jié)果比較

注：AB為處理前，CD為處理后

Fatima N, Chelius D et al. Label-free global serum proteomic profiling reveals novel celecoxib-modulated proteins in familial adenomatous polyposis patients. Cancer genomics proteomics.

文獻(xiàn)來源：Fatima N, Chelius D, Luke BT, Yi M, Zhang T, Stauffer S, Stephens R,Lynch P, Miller K, Guszczynski T et al: Label-free global serum proteomic profiling reveals novel celecoxib-modulated proteins in familial adenomatous polyposis patients. Cancer genomics proteomics 2009, 6(1):41-49.

二、iTRAQ定量

iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation，同重同位素標(biāo)簽標(biāo)記的相對和絕對定量)技術(shù)也是目前定量蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。

  iTRAQ試劑分為報告基團(tuán)、平衡基團(tuán)和肽反應(yīng)基團(tuán)。報告基團(tuán)共有8種（113、114、115、116、117、118、119、121 Da)。肽反應(yīng)基團(tuán)能與肽鏈N端及賴氨酸側(cè)鏈發(fā)生共價鏈接，從而將報告基團(tuán)和平衡基團(tuán)標(biāo)記在肽段上；平衡部分質(zhì)量分別為192~184，與報告部分相加正好為305。

  在一級質(zhì)譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標(biāo)記不同樣本中的同一蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。在二級質(zhì)譜中，iTRAQ試劑中的平衡基團(tuán)發(fā)生中性丟失，信號離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比(113~121) 的峰，根據(jù)波峰的高度及面積，可以得到同一蛋白在不同樣本中的表達(dá)差異；同時，肽段的MS/MS結(jié)果結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索可以鑒定出相應(yīng)的蛋白種類。

技術(shù)特點

靈敏度高：可檢測出較低豐度蛋白，胞漿蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等；

分離能力強：可分離出酸/堿性蛋白，小于10K或大于200K的蛋白、難溶性蛋白；

高通量：可同時對8個樣本進(jìn)行分析，特別適用于采用多種處理方式或來自多個處理時間的樣本的差異蛋白分析；

結(jié)果可靠準(zhǔn)確：定性與定量同步進(jìn)行，同時得出鑒定和定量結(jié)果。

自動化程度高：液質(zhì)連用，自動化操作，分析速度快，分離效果好。

適用范圍

適用于任何類型的樣本；

一次最多能標(biāo)記8個樣本；

經(jīng)典案例

題目：A tumour suppressor network relying on the polyamine-hypusine axis（一種基于多胺Hypusine軸（Polyamine-hypusine axis）的新型腫瘤抑制網(wǎng)絡(luò)）

期刊：Nature

主要技術(shù)：iTRAQ定量

文章摘要：為尋找淋巴瘤的抑癌基因，首先通過篩選短發(fā)夾RNA文庫的方法，識別出一些抑制后會引起小鼠淋巴瘤模型腫瘤擴增的基因。然后采用iTRAQ定量技術(shù)對兩個有意義的淋巴瘤抑癌基因——AMD1和Eif5A的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這兩個基因都與Hypusine(Hypusine是一種獨特的氨基酸，由一種高保守途徑產(chǎn)生的多胺代謝產(chǎn)物)相關(guān)。通過進(jìn)一步的二次篩選，確定了多胺Hypusine軸的新型抑癌基因網(wǎng)絡(luò)，這一網(wǎng)絡(luò)能調(diào)控細(xì)胞凋亡。

     

圖：iTRAQ定量流程和蛋白質(zhì)比值分布圖

Scuoppo C, Miething C et al. A tumour suppressor network relying on the polyamine-hypusine axis. Nature.

文獻(xiàn)來源：Scuoppo C, Miething C, Lindqvist L, Reyes J, Ruse C, Appelmann I,Yoon S, Krasnitz A, Teruya-Feldstein J, Pappin D et al: A tumour suppressor network relying on the polyamine-hypusine axis. Nature2012, 487(7406):244-248.

三、SILAC定量

  SILAC（Stable Isotope Labeling Strategies,穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)）為全面、系統(tǒng)地定性和定量分析復(fù)雜哺乳動物細(xì)胞蛋白質(zhì)組提供了有效的方案。

  SILAC的基本原理是分別用天然同位素(輕型)或穩(wěn)定同位素(中性或重型)標(biāo)記的必需氨基酸取代細(xì)胞培養(yǎng)基中相應(yīng)氨基酸，細(xì)胞經(jīng)5-6個倍增周期后，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸完全摻入到細(xì)胞新合成的蛋白質(zhì)中替代了原有氨基酸。不同標(biāo)記細(xì)胞的裂解蛋白按細(xì)胞數(shù)或蛋白量等比例混合，經(jīng)分離、純化后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，根據(jù)一級質(zhì)譜圖中兩個同位素型肽段的面積比較進(jìn)行相對定量，屬于體內(nèi)代謝標(biāo)記法。

技術(shù)特點

高效性：SILAC是體內(nèi)標(biāo)記技術(shù)，標(biāo)記效率可高達(dá)100%；

定量精確，線性范圍廣，降低由于樣品制備、實驗操作和儀器設(shè)備造成的實驗誤差，定量重復(fù)性好；

體內(nèi)代謝標(biāo)記與SDS-PAGE或色譜分離技術(shù)相結(jié)合，兼容疏水性蛋白和偏堿性蛋白，不受蛋白性質(zhì)限制；

由于該技術(shù)屬于體內(nèi)標(biāo)記，標(biāo)記效果穩(wěn)定，其標(biāo)記效率不受裂解液的影響，不僅適合于進(jìn)行全細(xì)胞蛋白的分析，還適合于膜蛋白的鑒定和定量；

與化學(xué)標(biāo)記相比，SILAC方法蛋白需要量明顯減少，通常每個樣品只需要幾十微克的蛋白量；

活體標(biāo)記，更接近樣品真實狀態(tài)；

相容性：可以對多種在DMEM或RPMI 1640培養(yǎng)基中能夠培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)菌中表達(dá)的蛋白進(jìn)行標(biāo)記。

適用范圍

只適用于活體培養(yǎng)的細(xì)胞，對于生物醫(yī)學(xué)研究中常用的組織樣品、體液樣品等無法分析。

經(jīng)典案例

題目：Proteome-wide Mapping of Cholesterol-Interacting Proteins in Mammalian Cells（采用甾醇探針結(jié)合SILAC定量技術(shù)在哺乳動物細(xì)胞中分析膽固醇-蛋白質(zhì)相互作用）

期刊：Nat Methods

主要技術(shù)：SILAC定量

文章摘要：膽固醇是細(xì)胞膜的重要結(jié)構(gòu)成分，也是前體的信號分子，在很大程度上通過與蛋白質(zhì)的特異性相互作用調(diào)控參與發(fā)揮其作用。本文采用可點擊的光敏甾醇探針結(jié)合SILAC蛋白質(zhì)組定量技術(shù)直接在活體細(xì)胞中全面解析了膽固醇-蛋白相互作用。最終確定了超過250個膽固醇結(jié)合蛋白，包括受體、通道蛋白和涉及許多已建立和之前未報告相互作用的酶。新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)相互作用中最突出的是調(diào)節(jié)糖、甘油脂和膽固醇本身以及參與囊泡運輸和蛋白質(zhì)糖基化和降解蛋白質(zhì)的酶。這些蛋白指向關(guān)鍵節(jié)點的生化途徑，說明甾醇濃度和其他代謝物的控制可能和蛋白定位以及修飾高度相關(guān)。

   

           圖：實驗基本流程           圖：膽固醇生物合成通路

                 

注：黑色字符蛋白表示沒有鑒定         

Jonathan J et al. Proteome-wide Mapping of Cholesterol-Interacting Proteins in Mammalian Cells. Nature methods.                                                                             

文獻(xiàn)來源：Jonathan J, Armand B, Micah J, Sarah E, Benjamin F: Proteome-wide Mapping of Cholesterol-Interacting Proteins in Mammalian Cells.Nature methods, 2013 March; 10(3):259-264.

四、SWATH定量

  SWATH（Sequential Window Acquisition of all Theoretical Mass Spectra）是瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的Ruedi Aebersold 博士及其團(tuán)隊與AB-SCIEX于2012年聯(lián)合推出的一項全新的質(zhì)譜采集模式技術(shù)，是 MS/MSALL技術(shù)的一種擴展。它將掃描范圍劃分為以25 Dalton為間隔的一系列區(qū)間，通過超高速掃描來獲得掃描范圍內(nèi)全部離子的所有碎片信息。

技術(shù)特點

靈敏度高：SWATH技術(shù)繼承了MRM的數(shù)據(jù)采集模式，結(jié)合高分辨率的AB sciex Triple TOF-plus，具有與MRM相當(dāng)?shù)撵`敏度；

可重現(xiàn)性高：重復(fù)樣品間的定量相關(guān)性可達(dá)0.99以上；

線性動態(tài)范圍廣：定量范圍可跨越4個數(shù)量級；

通量大：一次實驗可檢測到2000種以上蛋白并定量。

適用范圍

最好檢測細(xì)菌等復(fù)雜度較低的樣品；

可以和MRM技術(shù)聯(lián)合使用發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物；

可以和TAP技術(shù)聯(lián)合使用鑒定相互作用蛋白。

經(jīng)典案例

題目：SWATH-and iTRAQ-based quantitative proteomic analyses reveal an overexpression and biological relevance of CD109 in advanced NSCLC (利用SWATH和iTRAQ定量技術(shù)揭示CD109在晚期非小細(xì)胞肺癌的過表達(dá)和生物相關(guān)性)

期刊：Journal of proteomics

主要技術(shù)：SWATH、iTRAQ

文章摘要：文章采用iTRAQ和SWATH定量技術(shù)，對癌細(xì)胞高轉(zhuǎn)移和低轉(zhuǎn)移非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中蛋白的表達(dá)量變化（分別與正常狀態(tài)比較）進(jìn)行了分析。分別在細(xì)胞系分泌蛋白組和非小細(xì)胞肺癌血清中找到110個和71個存在顯著差異的蛋白。研究者發(fā)現(xiàn)，在這些差異蛋白中，CD109在高度轉(zhuǎn)移的細(xì)胞系分泌蛋白組和癌癥晚期患者組都有較高的表達(dá)量，ELISA檢測也得到相同的結(jié)論。另外，和正常肺細(xì)胞比較，CD109在肺癌細(xì)胞中也高度表達(dá)。研究者還發(fā)現(xiàn)，敲出CD109蛋白會影響NSCLC細(xì)胞的生物功能，如抑制細(xì)胞生長、影響細(xì)胞循壞階段等。這些現(xiàn)象表明，CD109在NSCLC的進(jìn)程中扮演著重要角色，很有可能是肺癌發(fā)病一個關(guān)鍵的生物標(biāo)志物。

 

圖：SWATH定量蛋白表達(dá)量比值分布

iTRAQ定量和SWATH定量蛋白比值相關(guān)性分布