蛋白提取的常見問題分析
瀏覽次數(shù):2760 發(fā)布日期:2017-2-15
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Q:如何進行組織液氮研磨?
A:將組織塊在液氮里凍實,敲成大小合適的小塊后放在研缽里,倒液氮,邊研邊加,保持研缽里有液氮,或是保持組織塊不融。研碎了就行了。注意做前研缽等器具要預(yù)冷,用液氮或是先放負(fù)二十冰箱一段時間。
注意事項:1.液氮研磨的研缽,藥勺必須預(yù)冷。2.開始研磨前,將研缽置于冰袋上,并加入少量的液氮,快速將樣品轉(zhuǎn)入其中。3.繼續(xù)加入液氮,快速搗碎樣品,然后快速研磨。4.待液氮揮發(fā)完前,繼續(xù)加入液氮,快速淹沒,重復(fù)操作,待樣品變成非常細小的白色干粉時即可。5.將干粉刮下轉(zhuǎn)入裂解液中,再加裂解液于研缽中,將其中的黏附的樣品洗下。整個過程保持樣品處于溫度低的環(huán)境,研磨的速度要快而有力度。這樣才能破碎細胞,同時不降解蛋白。
Q:膜蛋白不溶于loading buffer,或者煮沸后形成沉淀怎么辦?
A:用60度變性1h;如果還是不行,把loading buffer的SDS換成LDS。
Q:多少細胞提的蛋白夠做western blot?
A:一般5×106足夠。但要看是哪種細胞,有的細胞的體積就很小,而有的細胞則鋪得很開。常規(guī)做WB一個孔道上樣要105個細胞。但也和目的蛋白及提取的方式有關(guān)。如果是膜蛋白或是某細胞器內(nèi)分布的蛋白細胞數(shù)得增多。
Q:同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎?
A:可以,甚至可以同時測十幾種樣品。
Q:蛋白提取后可以存放多久?
A:-80℃,一年沒有問題。關(guān)鍵兩條:不要被蛋白酶水解掉;不要被細菌污染
Q:提取蛋白后做WB一般一次上樣的蛋白總量是多少,跟目的蛋白的表達量有關(guān)系嗎?
A:Western Blot一般上樣30-100微克不等,結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和撫育時間都有關(guān)系,也與顯色時間長短有關(guān)。開始摸條件時,為了拿到陽性結(jié)果,各個步驟都可以量多一點時間長一點,當(dāng)然背景也就出來了。要拿到好的結(jié)果,如果抗體好的話比較容易,抗體不好的話就需要反復(fù)地試了,當(dāng)然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。所以拿到好的結(jié)果不容易。
Q:做組織樣品蛋白的western的時候,提取蛋白有什么特別注意的嗎?
A:必須進行研磨、勻漿處理,蛋白質(zhì)溶解度會更好,離心要充分,還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強,需要注意抑制蛋白酶的活性(加入PMSF和蛋白酶抑制劑cocktail)。