藥物雜質(zhì)因其可能對藥品質(zhì)量、安全性和有效性產(chǎn)生影響，目前成為國內(nèi)外藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)的重點(diǎn)關(guān)注內(nèi)容之一。隨著我國醫(yī)藥產(chǎn)品出口規(guī)模的擴(kuò)大，了解國外法規(guī)市場的藥物雜質(zhì)控制要求、加強(qiáng)對藥物雜質(zhì)的分析與控制已成為國內(nèi)藥品生產(chǎn)企業(yè)共同關(guān)注的話題。

 

任何影響藥物純度的物質(zhì)統(tǒng)稱為雜質(zhì)，人用藥物注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)（簡稱ICH）對雜質(zhì)的定義為藥物中存在的，化學(xué)結(jié)構(gòu)與該藥物不一致的任何成分。藥物中含有雜質(zhì)會(huì)降低療效，影響藥物的穩(wěn)定性，有的甚至對人體健康有害或產(chǎn)生其他毒副作用。因此，檢測有關(guān)物質(zhì)，控制純度對確保用藥安全有效，對保證藥物質(zhì)量非常重要。

 

雜質(zhì)譜分析是指研究藥物中存在的已知和未知的雜質(zhì)的分布情況，分析藥物中雜質(zhì)的來源和去向，通過雜質(zhì)譜的研究，可以全面的評估藥物的安全性。對于藥物生產(chǎn)階段，雜質(zhì)譜研究可以在工藝過程中建立完整可靠的雜質(zhì)分析方法，對工藝的關(guān)鍵步驟監(jiān)控雜質(zhì)的變化情況，驗(yàn)證雜質(zhì)分析方法并轉(zhuǎn)移到QA/QC，對于藥物研發(fā)階段，需要對藝研發(fā)過程中的雜質(zhì)進(jìn)行鑒定和表征并進(jìn)一步確認(rèn)雜質(zhì)的來源，研發(fā)人員根據(jù)分析結(jié)果可以評價(jià)藥物的安全性和與原研藥的一致性，并根據(jù)雜質(zhì)來源進(jìn)一步優(yōu)化工藝，降低或消除雜質(zhì)的產(chǎn)生。

 

有機(jī)雜質(zhì)主要起源于起始原料及其本身所含雜質(zhì)、生產(chǎn)過程中帶入的合成中間體與副反應(yīng)產(chǎn)物、成品在儲存過程中產(chǎn)生的降解產(chǎn)物，輔料帶入的雜質(zhì)或輔料相互作用降解產(chǎn)生的雜質(zhì)，及藥物與包材相互作用產(chǎn)生的雜質(zhì)。有機(jī)雜質(zhì)在成品藥物中含量通常很低，制備純化需要消耗大量人力物力，常規(guī)分析方法難以應(yīng)對多組分、低含量的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)解析工作。離子阱質(zhì)譜儀，因其靈敏的MSn 能力，復(fù)雜樣品的高通量常規(guī)分析，高質(zhì)量的結(jié)構(gòu)信息，快速正負(fù)離子切換技術(shù)，快速正負(fù)離子切換技術(shù)，穩(wěn)定、可靠、便于操作，被廣泛的應(yīng)用于藥物雜質(zhì)研究，臨床和法醫(yī)鑒定，天然化合物鑒定，代謝物鑒定等領(lǐng)域。

 

 

藥物中的雜質(zhì)往往含量很小，在大量的母藥存在下，檢測到微量的雜質(zhì)是對質(zhì)譜技術(shù)的一大挑戰(zhàn)，采集到雜質(zhì)的質(zhì)譜信息后，對這些工藝雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行有效的解析是另一大挑戰(zhàn)。Thermo 的離子阱技術(shù)有效地解決了以上雜質(zhì)研究難題，其高靈敏度和寬廣的動(dòng)態(tài)范圍能夠采集到微量雜質(zhì)的有效質(zhì)譜信息，離子阱的多級質(zhì)譜能力和強(qiáng)大的解析軟件可以對雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的剖析，同時(shí)結(jié)合色譜高效的分離能力和專業(yè)的結(jié)構(gòu)解析軟件，Thermo 建立了專門針對雜質(zhì)分析的解決方案。

 

 

圖1. 基于離子阱的雜質(zhì)解析流程

 

 

離子阱是時(shí)間串聯(lián)的質(zhì)譜技術(shù)，化合物離子的捕獲，隔離，激發(fā)和拋射都在阱中完成，正因如此，離子阱重復(fù)此掃描過程即可完成多級碎裂（MSⁿ）。

 

 

圖2. 離子阱時(shí)間串聯(lián)掃描

 

離子阱中的穩(wěn)定區(qū)域可以通過馬紹方程計(jì)算出來，化合物離子在特定的射頻電壓下按照特定頻率移動(dòng)，增加RF 電壓， 離子的頻率（q 值）將會(huì)增加，逐漸提高射頻, 使離子從低m/z 到高m/z 逐漸依次離開，完成掃描。

 

 

圖3. 離子阱掃描原理

 

作為離子阱質(zhì)譜的領(lǐng)導(dǎo)者，Thermo 專利的線性離子阱提供最快的速度同時(shí)保證優(yōu)異的靈敏度

● 離子沿著中心線方向聚集，同時(shí)也減少了空間電荷效應(yīng)，極大提高離子容量；

● 雙徑向檢測器設(shè)計(jì)同時(shí)檢測離子，離子檢測速度更快，響應(yīng)強(qiáng)度更高，信號更加穩(wěn)定；

● 離子捕獲效率更高，獲得更高的靈敏度，進(jìn)行更多級數(shù)的碎裂；

 

● 最大序列覆蓋率，源自卓越的循環(huán)時(shí)間和靈敏度

● 自動(dòng)MSn 觸發(fā)數(shù)據(jù)依賴中性丟失掃描

● 靈活的離子化模式、進(jìn)樣口和色譜解決方案

 

● 優(yōu)異的離子統(tǒng)計(jì)學(xué)使定量穩(wěn)定可靠

● 碰撞能量歸一化獲得最高工作效率

● 為規(guī)范實(shí)驗(yàn)室提供同時(shí)定性和定量數(shù)據(jù)

 

● 持久穩(wěn)定性適應(yīng)復(fù)雜基質(zhì)樣品可靠定量

● 正、負(fù)離子模式下同時(shí)定量和定性

● 簡便地操作提高實(shí)驗(yàn)室效率

 

● 出色的MSn 譜圖質(zhì)量和全掃描采集技術(shù)

● 低濃度代謝物結(jié)構(gòu)確認(rèn)，無需了解MRM 信息

● 數(shù)據(jù)依賴和動(dòng)態(tài)排除技術(shù)可以從復(fù)雜樣品中獲得最多信息

 

 

Thermo 離子阱提供豐富的采樣模式，既有通用模板幫助快速建立分析方法，又有拓展功能滿足深入分析的需要。

 

 

注：Zoom 掃描是通過降低掃描速度增加分辨率的一種離子阱掃描方式

 

雜質(zhì)研究過程中通常需要對藥物中的已知或目標(biāo)雜質(zhì)進(jìn)行分析，離子阱的選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）可對雜質(zhì)特定的母離子和子離子進(jìn)行掃描，保證結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性，連續(xù)反應(yīng)監(jiān)測（CRM）更可對雜質(zhì)特定的母離子，子離子和多級離子進(jìn)行掃描，獲得更高的靈敏度和抗干擾能力。下圖中采用SRM 對目標(biāo)化合物的母離子m/z 258 和子離子進(jìn)行掃描，可看到在2.65min 有一明顯色譜峰，在采用CRM 進(jìn)一步對目標(biāo)化合物的三級離子m/z 133 進(jìn)行掃描后，2.65min 的化合物背景干擾明顯降低，信噪比有了大幅提升。

 

 

圖4. 多級質(zhì)譜提供更高的特異性與靈敏度

 

未知雜質(zhì)的鑒定是雜質(zhì)研究工作中非常重要的一部分內(nèi)容，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)未知，如何采集到準(zhǔn)確的雜質(zhì)母離子和多級質(zhì)譜信息成為結(jié)構(gòu)解析的前提和關(guān)鍵。數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)多級質(zhì)譜及動(dòng)態(tài)掃描功能可以實(shí)現(xiàn)對未知雜質(zhì)信號的采集。

 

如下圖所示，離子阱通過一級掃描，獲得化合物質(zhì)譜信息，根據(jù)質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)弱自動(dòng)選擇母離子進(jìn)行多級質(zhì)譜掃描，一次進(jìn)樣即可獲得雜質(zhì)多級質(zhì)譜信息。

 

 

圖5. 數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)掃描同時(shí)采集已知與未知雜質(zhì)

 

在采用數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)掃描對洛哌丁胺藥物的分析中，離子阱通過全掃獲得一級質(zhì)譜信號，然后對響應(yīng)最強(qiáng)的洛哌丁胺母離子進(jìn)行二級碎裂，然后自動(dòng)選則m/z 266 和m/z 210 兩個(gè)主要二級離子進(jìn)行三級碎裂，緊接著對由二級離子m/z 266 產(chǎn)生的三級離子m/z 210 和m/z 238 進(jìn)行四級碎裂。數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)掃描可以在一次進(jìn)樣內(nèi)，即自動(dòng)完成多級質(zhì)譜過程，無需預(yù)先知道樣品中的化合物信息，提高了分析通量和數(shù)據(jù)信息量。

 

 

圖6. 數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)掃描采集洛哌丁胺多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)

 

動(dòng)態(tài)排除功能：在藥物雜質(zhì)研究中，常涉及到從液相方法到液質(zhì)方法的轉(zhuǎn)移過程，而液質(zhì)方法因?yàn)榱鲃?dòng)相與液相不同，往往無法在短時(shí)間內(nèi)將所有雜質(zhì)分離，離子阱具有動(dòng)態(tài)排除功能，開啟后可以對所有共流出雜質(zhì)進(jìn)行多級碎裂，以應(yīng)對色譜未完全將雜質(zhì)分離的情況。

 

在下圖中，化合物m/z 452和m/z 407發(fā)生了共流出，開啟動(dòng)態(tài)排除后，儀器首先對響應(yīng)較高的m/z 407進(jìn)行二級碎裂，然后將m/z 407 放入排除列表，在下一次全掃中，響應(yīng)較高的m/z 407 即作為排除項(xiàng)，轉(zhuǎn)而選擇響應(yīng)較弱的m/z 452 進(jìn)行二級碎裂。所以在一個(gè)色譜峰內(nèi)，即使有多個(gè)化合物存在，動(dòng)態(tài)排除都能保證采集到每個(gè)化合物的多級質(zhì)譜信號。

 

 

圖7. 動(dòng)態(tài)排除采集共流出雜質(zhì)組分

 

 

雜質(zhì)的種類繁多，即使是相同元素組成的化合物，結(jié)構(gòu)也可能完全不同，所以需要對采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行有效的解析，對推測的結(jié)構(gòu)式進(jìn)行判斷，Mass FrontierTM為質(zhì)譜譜圖的管理、評估和解析提供精密的特性。它可廣泛應(yīng)用于小分子結(jié)構(gòu)鑒定，應(yīng)用范圍涉及包括藥物開發(fā)、雜質(zhì)的分析和毒理研究過程中代謝產(chǎn)物的識別等廣闊領(lǐng)域。

 

 

圖8. Mass Frontier結(jié)構(gòu)解析軟件

 

使用Massfrontier，研究人員可以方便的從已采集的數(shù)據(jù)中獲取以下信息：

 

● 化合物的裂解機(jī)理

因?yàn)殡s質(zhì)的結(jié)構(gòu)和母藥的結(jié)構(gòu)往往類似或者具有淵源，所以了解母藥的裂解規(guī)律可以幫助判斷雜質(zhì)的碎片結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步推測出雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

 

以前的方法僅僅依靠研究者的個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，或者純理論的計(jì)算，使得數(shù)據(jù)分析的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性受到了限制。

 

 

圖9. 傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)解析方法

 

Mass Frontier 所含有的Fragmentation LibraryTM 碎裂機(jī)理譜圖庫是從現(xiàn)存的所有關(guān)于質(zhì)譜的出版物中收集而來，幾乎涵蓋了所有已發(fā)表的文獻(xiàn)。每一種機(jī)理，連同其化學(xué)結(jié)構(gòu)，都經(jīng)過人工和自動(dòng)核對，然后連同標(biāo)題、作者及信息來源等附帶信息一塊儲存于譜圖庫中。譜圖庫所收集的信息，加上通用的電離、碎裂和重組規(guī)則，為碎裂機(jī)理的預(yù)測提供了有力的保障。Mass Frontier 還可以允許用戶創(chuàng)建基于客戶自定義碎裂機(jī)理上的譜圖庫，并能學(xué)會(huì)并運(yùn)用這些機(jī)理來智能預(yù)測碎片分子。

 

 

圖10. Fragmentation Library根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)提供霉酚酸酯雜質(zhì)裂解機(jī)理

 

● 有關(guān)物質(zhì)的檢獲

一些雜質(zhì)組分會(huì)因?yàn)樾盘栱憫?yīng)太低，或者形成的色譜峰不夠尖銳，而被研究人員忽略，但是含量很低的毒性雜質(zhì)嚴(yán)重的影響藥物安全性，漏檢不僅會(huì)極大的影響用藥的安全性，也會(huì)間接影響到新藥申報(bào)。

 

MassFrontier 的Fragment Ion Search (FISh) 可通過過濾無論是由理論裂解預(yù)測還是由實(shí)驗(yàn)MSn 質(zhì)譜譜樹獲得的一組裂解碎片可對結(jié)構(gòu)相似化合物進(jìn)行快速篩選，通過雜質(zhì)與母藥的碎片比對查找，精確的找出所有有關(guān)雜質(zhì)。

 

 

圖11. Fragment Ion Search (FISh)檢索霉酚酸酯痕量雜質(zhì)

 

線性離子阱多種解離技術(shù)對阿德福韋酯雜質(zhì)譜的全面鑒定