Theresa Lynch 1 ; Kate Comstock 2 ; Jack Cunniff 2
1 Gilead Sciences, 333 Lakeside Dr, Foster City, CA;  2 Thermo Fisher Scientific,
355 River Oaks Parkway, San Jose, CA

前言

活性藥物成分（API）和成品藥的雜質(zhì)分析是藥物研發(fā)中不可或缺的一環(huán)。雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息在評估毒性、改進合成途徑，以及根據(jù)目標(biāo)成藥選擇最佳劑型至關(guān)重要。為保證藥效與消費者的安全，世界各國的監(jiān)管機構(gòu)都制定了藥物雜質(zhì)分析的指引，清楚說明基于日服用量、使用時間，和藥物靶標(biāo)的限量標(biāo)準(zhǔn)。

LCMS 已經(jīng)成為最常用的未知雜質(zhì)分析技術(shù)。為了能在大量母藥中識別并表征痕量雜質(zhì)，具有高靈敏度、高掃描速度，并且能進行多級質(zhì)譜分析（MS n ） 的質(zhì)譜儀必不可少。在本研究中，Sigma-Aldrich 所售的研究級阿德福韋酯（adefovir dipivoxil，ADP） 被用來作為模型化合物進行 API雜質(zhì)分析。ADP 是廣泛用于慢性乙肝病毒感染的一種抗病毒處方藥。本研究中使用的 LCMS 系統(tǒng)由 Thermo ScientificAccela TM UHPLC以及 Velos Pro TM 雙壓線性離子阱質(zhì)譜儀構(gòu)成。碎片信息通過結(jié)合應(yīng)用 CID 與 Trap-HCD 解離技術(shù)獲得。數(shù)據(jù)處理通過軟件 Mass Frontier TM 完成。

分析方法

材料與試劑
阿德福韋酯（Adefovir dipivoxil，CAS# 142340-99-6）從 Sigma-Aldrich 購得，產(chǎn)品號 A9730。
乙腈和水 （Fisher）；乙酸銨（Sigma-Aldrich，產(chǎn)品號73594-25G-F）；甲酸（Sigma-Aldrich，產(chǎn)品號 33015-
500ml）。

樣品制備
  ADP溶液，0.5mg/mL，用 1 ml 20 : 80 的乙腈和水混合溶劑溶解 0.5mg ADP 獲得。

HPLC方法
  HPLC系統(tǒng)：Thermo Accela 1250 泵，開放式 Accela 自動進樣器及 Accela PDA
  色譜柱： Hypersil GOLD C18 2.1×150 mm，3 µM，
  Thermo Scientific 產(chǎn)品號 071399
  柱溫：35 ℃
  流速：0.5 ml/ 分鐘
  進樣體積：8 μl
  流動相：A – 水，B – 乙腈，C - 100 mM 乙酸銨，用乙酸調(diào)至 pH 5
  梯度洗脫：
           時間（min） A%   B%   C%
                 0    80   10   10
               12.0   20   70   10
               14.0   20   70   10
               14.1   10   80   10
               15.0   10   80   10
               15.1   80   10   10
               19.0   80   10   10

質(zhì)譜方法
  質(zhì)譜儀：配有 HESI-II 離子源的 Velos Pro TM 雙壓線性離子阱
  離子化條件：電噴霧， 正離子模式
    1. 全掃模式 m/z 120-1000 amu/ Top5 dd MS/MS，HCD NCE 35%
    2. 全掃模式 / 按母離子列表 dd MS 2 / TOP 3 ddMS 3 ,CID/Trap-HCD NCE 20%
        a. CID MS 2 / CID MS 3
        b. CID MS 2 / HCD MS 3
        c. HCD MS 2 / CID MS 3
        d. HCD MS 2 / HCD MS

結(jié)果與討論

I. 全掃—Top5 HCD dd MS/MS 與“FISh”
ADP 雜質(zhì)譜分析流程由兩次連續(xù)的 LCMS 實驗構(gòu)成。分析目標(biāo)是為雜質(zhì)鑒定和結(jié)構(gòu)解析收集盡可能多的信息。
第一個 MS 實驗包括全掃描和后續(xù)的 Top5 HCD 數(shù)據(jù)依賴MS/MS 掃描（圖 1）。 接下來，數(shù)據(jù)通過 Mass Frontier 當(dāng)中的 Fragment Ion Search（碎片離子檢索，F(xiàn)ISh）算法進行處理，這是一個新穎的進行雜質(zhì)檢出及鑒定的方法，主要基于母離子解離模式的比較（圖 2a，b）。與母藥擁有相同碎片的成分會被“FISh”識別出來，見圖 3。

II.Trap-HCD/CID MS 2 和 MS 3 為未知化合物的結(jié)構(gòu)解析
提供豐富的碎片信息進一步的結(jié)構(gòu)信息通過結(jié)合母化合物列表、使用 Trap-HCD和 CID 解離組合進行 MS 3 實驗獲得。當(dāng)歸一化的碰撞能量水平相同時，Trap-HCD 比 CID 生成的碎片譜圖信息更豐富。Trap-HCD 沒有低質(zhì)量數(shù)歧視效應(yīng)，見圖 4。CID MS n 能夠提供步進的裂解信息，對結(jié)構(gòu)解析非常有價值，見圖 5，6。

- 全掃,CID dd MS² （設(shè)定母離子列表），然后對前三的MS² 碎片離子進行 HCD MS³
- 全掃,CID dd MS² （設(shè)定母離子列表），然后對前三的MS² 碎片離子進行 CID MS³
- 全掃,HCD dd MS² （設(shè)定母離子列表），然后對前三的MS² 碎片離子進行 CID MS³
- 全掃,HCD dd MS² （設(shè)定母離子列表），然后對前三的MS² 碎片離子進行 HCD MS³





根據(jù)豐富的 HCD、CID MS 2 和 MS 3 碎片信息（見圖 7），對鑒定出的雜質(zhì)化合物進行了結(jié)構(gòu)預(yù)測。每個雜質(zhì)組分的精確質(zhì)量數(shù)和元素組成通過臺式 Orbitrap Q Exactive TM 質(zhì)譜儀的高分辨數(shù)據(jù)確認(rèn)。

結(jié)論
兩種解離技術(shù)—Trap-HCD 和 CID—被用來表征市售研究級阿德福韋酯（adefovir dipivoxil）樣品中的十三種低含量雜質(zhì)。當(dāng)歸一化的碰撞能量水平相同時，Trap-HCD 比 CID 生成的碎片譜圖信息更豐富。Trap-HCD 不存在低質(zhì)量歧視效應(yīng)。另一方面，CID 能夠提供逐級裂解信息和 MSn 譜圖，對于闡明子結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)非常有價值。本研究的結(jié)果證明，結(jié)合數(shù)據(jù)后處理軟件使用這兩種互補的解離方式能夠出色完成雜質(zhì)鑒定與結(jié)構(gòu)解析，提高了未知雜質(zhì)分析的速度與可靠性。