Cristian Cojocariu,1 Dominic Roberts,1 Michael T. Hetmanski,2 Richard J. Fussell,2 and Paul Silcock1

1Thermo Fisher Scientific, Runcorn, UK

2Food and Environment Research Agency (FERA), York, UK

 

嬰兒食品；精確質(zhì)量；篩查；食品安全；GC Orbitrap；高分辨 GC-MS；農(nóng)殘分析；定量分析；TraceFinder

 

農(nóng)藥是廣泛用于控制蟲害的化學(xué)物質(zhì)，可以用于昆蟲、植物病害和野草等對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成危害的生物。農(nóng)藥使用后可能會(huì)在作物上殘留下來(lái)，因此，對(duì)這類化合物的使用都會(huì)進(jìn)行嚴(yán)格的監(jiān)管，以確保殘留不會(huì)超過(guò)規(guī)定允許的最大殘留水平（MRLs）1。

 

農(nóng)藥分析大都使用基于液相色譜（LC）和氣相色譜（GC）方法進(jìn)行的。GC與質(zhì)譜（MS）聯(lián)用儀被農(nóng)殘檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室廣泛使用，因?yàn)樵S多農(nóng)藥并不適合用 LC-MS分析，或是在“軟”電離的條件下離子化效率不高。GC的分離效率比較好，并且有包括單四極桿或三重四極桿在內(nèi)的多種質(zhì)譜檢測(cè)器可以選擇。四極桿質(zhì)量分析器是一款選擇性、靈敏度、經(jīng)濟(jì)性都非常好的質(zhì)量分析器，不過(guò)只能達(dá)到單位質(zhì)量分辨率（nominal mass resolution）。當(dāng)使用四極桿質(zhì)譜儀時(shí)，通過(guò)選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）或選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）即可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)農(nóng)藥與化學(xué)背景的選擇性分離。SIM 和 SRM 皆適用于定靶分析實(shí)驗(yàn)，在這類分析中通常會(huì)根據(jù)一個(gè)預(yù)先確定好的農(nóng)藥列表對(duì)質(zhì)譜儀進(jìn)行一些參數(shù)設(shè)定。這樣一來(lái)，在分析中就確定了要監(jiān)測(cè)的化合物，從而限制了分析的范圍，并對(duì)未知及未定靶的化合物產(chǎn)出假陰性（未檢出）的結(jié)果，進(jìn)而為食品安全帶來(lái)隱患。

 

這一局限性促使科學(xué)家和業(yè)界人士開始不斷努力建立新分析方法，使用能夠以全掃模式運(yùn)行、質(zhì)量分辨率更高、而選擇性和定量表現(xiàn)堪比三重四極桿的質(zhì)譜分析儀。

 

到目前為止，高分辨精確質(zhì)量 GC-MS 儀器尚未被廣泛接受，主要因?yàn)槠淙珤哌x擇性和定量表現(xiàn)尚無(wú)法與以 SRM 模式運(yùn)行的三重四極桿比肩。

 

在本研究中，我們使用 GC 與 OrbitrapTM MS 聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行了嬰兒食品樣品的快速、高通量農(nóng)殘分析。通過(guò)進(jìn)行全掃分析，樣品中的農(nóng)殘一覽無(wú)遺，為分析呈上了一個(gè)完整、不受限制的視角。此外，堪比三重四極桿且符合 SANCO 指令的定量表現(xiàn)在本研究中也得到了呈現(xiàn)。

 

首先根據(jù)已發(fā)表的方法4，使用檸檬酸緩沖液和 QuEChERS 流程對(duì)嬰兒食品樣品進(jìn)行萃取。然后向終提取液（1 g/mL，乙腈為溶劑）中添加 132 種農(nóng)藥的混合物，其中大部分被分析物的濃度范圍為 0.5–100 ng/g （ppb），其余為 1.0–200 ng/g。

 

全部分析均使用 Thermo ScientificTM Q ExactiveTM GC 組合四極桿 –Orbitrap 質(zhì)譜儀進(jìn)行。進(jìn)樣使用的是 Thermo ScientificTM TriPlusTM RSH 自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜分離使用 Thermo ScientificTM TRACETM 1310 GC，色譜柱為 Thermo ScientificTM TraceGOLDTM TG-5SilMS 15 m × 0.25 mm I.D. × 0.25 μm 薄膜毛細(xì)管柱 （P/N： 26096-1301）。更多儀器參數(shù)及細(xì)節(jié)參見(jiàn)下表。

 

GC 及進(jìn)樣器條件
TRACE 1310 GC 參數(shù)
進(jìn)樣體積（μL）：	1.0
襯管：	非對(duì)稱反折型 （P/N： 45352062）
進(jìn)樣口溫度（℃）：	75
進(jìn)樣模塊及模式：	PTV，低溫不分流
PTV 傳輸延遲 （min）：	1
進(jìn)樣時(shí)間（min）：	0.1
傳輸速率（℃/sec）：	2.5
傳輸溫度（℃）：	300
PTV 　傳輸時(shí)間 （min）：	3
清潔速率 （℃/sec）：	330
載氣及流速（mL/min）：	氦氣，1.2
柱溫箱程序
溫度 1 （℃）：	40
保持時(shí)間 （min）：	1.5
溫度 2 （℃）：	180
升溫速率 （℃/min） ：	25
溫度 3 （℃）：	300
升溫速率 （℃/min） ：	100
保持時(shí)間 （min）：	3

 

Q Exactive GC 系統(tǒng)經(jīng)過(guò)調(diào)諧和校準(zhǔn)（使用校準(zhǔn)溶液 [FC 43，CAS 311-89-7] 中質(zhì)量數(shù)已知的標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜峰進(jìn)行），質(zhì)量精度達(dá)到 < 0.5 ppm RMS。離子化模式為電子轟擊電離（EI），掃描模式為全掃描，質(zhì)量分辨率為 60,000（峰高一半處的峰寬，在 m/z 200 處測(cè)定），符合 SANCO 關(guān)于高分辨率分析儀器的推薦分辨率標(biāo)準(zhǔn)2。

色譜數(shù)據(jù)采集確保不小于每個(gè)色譜峰不少于 12 個(gè)點(diǎn)，以保證峰面積積分的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

 

質(zhì)譜儀條件
Q Exactive 質(zhì)譜儀 參數(shù)
傳輸線溫度 （℃）：	280
離子化模式：	EI
離子源溫度（℃）：	230
電子能量 （eV）：	70
采集模式：	全掃
質(zhì)量范圍 （m/z）：	50–500
質(zhì)量分辨率（FWHM）：	60,000
鎖定質(zhì)量 （m/z）：             207.03235

 

數(shù)據(jù)采集和處理使用 Thermo ScientificTM TraceFinderTM 軟件進(jìn)行。 TraceFinder 軟件允許分析師為高通量篩查和定量分析建立數(shù)據(jù)采集和處理方法，還包含了譜庫(kù)檢索功能，數(shù)據(jù)審閱和報(bào)告也非常易用。

 

本研究的目的是為提高樣品通量及實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)效率的同時(shí)，對(duì)基于 Orbitrap 的 GC-MS 技術(shù)在農(nóng)藥快速篩查和定量方面的使用效果進(jìn)行評(píng)估。我們?cè)u(píng)估了多種分析參數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的詳細(xì)描述見(jiàn)下。

 

使用前述色譜條件即可實(shí)現(xiàn)良好的色譜分離。圖 1 給出了相同基質(zhì)中標(biāo)品（對(duì)應(yīng)濃度為 100/200 ng/g）的色譜峰樣圖。圖示為總離子譜圖及第一個(gè)（敵敵畏，RT = 4.46 min）和最后一個(gè)（溴氰菊酯，RT = 10.33 min） 洗脫的農(nóng)藥的提取離子譜圖 （XIC，±2 ppm 質(zhì)量提取窗口）。如已發(fā)表文獻(xiàn)所述4，快速分離是高樣品通量的必要條件。

 

當(dāng) GC運(yùn)行時(shí)間較短時(shí)，被分析物的色譜峰寬很窄，通常只有 2.5 秒。在峰寬如此窄的情況下，想要對(duì)每個(gè)色譜峰得到足夠多的掃描點(diǎn)就必須提高質(zhì)譜采集速率。如果色譜峰的數(shù)據(jù)采集點(diǎn)不足以確定出一個(gè)高斯峰形，目標(biāo)色譜峰的積分面積就很有可能出錯(cuò)，從而進(jìn)一步影響分析的重現(xiàn)性、峰形積分、以及目標(biāo)化合物的定量準(zhǔn)確性。使用 Q Exactive GC 系統(tǒng)在 60,000 分辨率下對(duì)嬰兒食品中的 EPTC 進(jìn)行分析時(shí)的典型掃描點(diǎn)分布情況如圖 2 所示。 除了采集到足夠的數(shù)據(jù)點(diǎn)之外（每峰 17 個(gè)點(diǎn)），每次掃描的質(zhì)量精度都非常好（0.5 ppm RMS）。

 

我們首先使用添加了農(nóng)藥的嬰兒食品進(jìn)行了一次簡(jiǎn)單的定靶篩查實(shí)驗(yàn)。使用 TraceFinder 軟件對(duì)一個(gè)含有 183 種農(nóng)藥數(shù)據(jù)的化合物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行這次分析。數(shù)據(jù)庫(kù)里包含了化合物名稱，至少 3 個(gè)碎片離子的理論精確質(zhì)量，以及樣品分析使用的色譜條件下的保留時(shí)間等信息�；�合物檢測(cè)和鑒定基于保留時(shí)間（±0.1 min 窗口）、精確質(zhì)量信息（±2 ppm 窗口）、同位素峰分布的相似度（理論與實(shí)際檢測(cè)），以及譜庫(kù)檢索結(jié)果（NIST 2014）進(jìn)行。通過(guò)使用這些比對(duì)信息，我們成功的在嬰兒食品樣本中檢出并確認(rèn)了所有 132 個(gè) 農(nóng)藥化合物（10/20 ng/g）。

 

 

圖 1. 總離子譜圖 （EI 全掃描）和第一個(gè) （敵敵畏，RT = 4.46 min） 及最后一個(gè)（溴氰菊酯，RT = 10.33 min） 洗脫的農(nóng)藥的提取離子譜圖（XIC）的疊加圖。對(duì)“相對(duì)豐度”（Y 軸） 進(jìn)行了調(diào)整以突出敵敵畏和溴氰菊酯的 XIC 圖。

 

 

圖 2. 狄氏劑的提取離子譜圖（XIC）（m/z 262.85642，±2 ppm 質(zhì)量窗口），每峰 17 個(gè)掃描點(diǎn)（峰寬 2.4 秒）。數(shù)據(jù)采集在全掃描模式下進(jìn)行，分辨率為 60,000 FWHM （精確分辨率見(jiàn)紅字注釋）。每個(gè)掃描點(diǎn)測(cè)得的精確質(zhì)量及質(zhì)量差異（ppm）已標(biāo)注。

 

 

圖 3. 10 ng/g 樣本中確定鑒定出的農(nóng)藥顯示在 TraceFinder 軟件篩查結(jié)果瀏覽器中�；�合物識(shí)別和確認(rèn)（以艾氏劑為例）的依據(jù)是準(zhǔn)確質(zhì)量（±2 ppm 質(zhì)量窗口）、 保留時(shí)間（RT）、同位素峰分布（IP） 和碎片離子（FI）。圖中可見(jiàn)測(cè)定的與理論的同位素峰。

 

圖 3 以艾氏劑為例展示了化合物檢測(cè)和鑒定工作流程。先將全掃模式下采集的數(shù)據(jù)解卷積，再使用保留時(shí)間和準(zhǔn)確質(zhì)量信息進(jìn)行化合物鑒定。艾氏劑的鑒定是基于 RT、定量離子和特征碎片離子的精確質(zhì)量（<0.5 ppm 質(zhì)量誤差）進(jìn)行的。此外，定量離子的元素組成（C7Cl5H2）也被用于比對(duì)理論和實(shí)際測(cè)得的同位素峰分布的吻合程度。如圖 3 所示，艾氏劑的同位素分布達(dá)到了 100% 吻合，進(jìn)一步提高了化合物鑒定結(jié)果的可靠性。

 

我們還就 Q Exactive GC 系統(tǒng)對(duì)化合物定量的分析表現(xiàn)針對(duì)所有 132 種農(nóng)藥進(jìn)行了評(píng)估。為此目的，我們?cè)?0.5–100 ng/g （或 1.0–200 ng/g）濃度區(qū)間內(nèi)配制了基質(zhì)工作曲線標(biāo)樣，并針對(duì)系統(tǒng)的靈敏度、線性區(qū)間、和峰面積重現(xiàn)性進(jìn)行了評(píng)估。此外，我們還在整個(gè)濃度區(qū)間內(nèi)評(píng)估了目標(biāo)農(nóng)藥的質(zhì)量精確度。

 

幾乎對(duì)所有農(nóng)藥（95%）都在最低濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)樣（0.5 或 1.0 ng/g）中實(shí)現(xiàn)了成功檢測(cè)。此濃度下的色譜圖實(shí)例參見(jiàn)圖 4。在 5 ng/g 濃度水平，所有化合物的離子比率值與整個(gè)工作曲線濃度范圍內(nèi)的離子比率均值的差異不超過(guò)15%。

 

為評(píng)估系統(tǒng)靈敏度，我們計(jì)算了每種農(nóng)藥的 IDL。目標(biāo)農(nóng)藥的 IDL 指的是在背景噪音之上、系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定、可靠檢測(cè)的最小信號(hào)。這個(gè)信號(hào)強(qiáng)度的確定是通過(guò)使用 5 ng/g （或 10 ng/g）基質(zhì)匹配樣品進(jìn)行反復(fù)（n=10）進(jìn)樣檢測(cè)，并計(jì)入相應(yīng)自由度下 Student’s-t 檢驗(yàn)的關(guān)鍵值（99% 置信區(qū)間）確定的。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的峰面積重現(xiàn)性的 % RSD 為 6% （圖 5）。

 

 

圖 4. 0.5 pg 特丁津（柱上濃度）的定量離子與三個(gè)確證碎片離子（左）的 XIC 疊加圖。每個(gè)離子的實(shí)測(cè)質(zhì)量及質(zhì)量誤差（ppm）已標(biāo)注。質(zhì)譜圖 （右）突出了定量和確證使用的離子，放大的區(qū)域顯示了強(qiáng)度最低的碎片離子（m/z 138.07737），檢測(cè)的質(zhì)量精度為 0.3 ppm。

 

 

圖 5. 所有 132 種測(cè)定的農(nóng)藥在柱上5 或10 pg 濃度水平下的絕對(duì)峰面積可重現(xiàn)性 （% RSD，n=10）。圖示為平均 %RSD 值（實(shí)線）。

 

Q Exactive GC 系統(tǒng)農(nóng)殘檢測(cè)的所有 IDL 均低于歐盟針對(duì)嬰兒食品規(guī)定的典型 MRL。目前絕大部分農(nóng)藥的 MRL 都定為<0.01 mg/kg（10 ng/g）3 。我們還與 Thermo ScientificTM TSQTM 8000 Evo 三重四極桿 GC-MS/MS 系統(tǒng)檢測(cè)相同農(nóng)藥的IDL 進(jìn)行了比較。本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明 Q Exactive GC 系統(tǒng)與 TSQ 8000 Evo GC-MS/MS 系統(tǒng)的靈敏度相當(dāng)，91% 的被測(cè)農(nóng)藥 IDL < 2 ng/g （圖 6）。

 

 

圖 6. Q Exactive GC 系統(tǒng) （左）與 TSQ 8000 Evo GC-MS/MS 系統(tǒng) （右）分析 5 ng/g 基質(zhì)匹配標(biāo)樣中 132 種農(nóng)藥的計(jì)算 IDL99（ng/g）值比較。圖中標(biāo)出了相對(duì)于目標(biāo)化合物總數(shù)（132）的農(nóng)藥百分比以及相應(yīng)的 IDL 區(qū)間。

 

能夠持續(xù)穩(wěn)定測(cè)定準(zhǔn)確質(zhì)量的能力對(duì)于農(nóng)殘鑒定和利用儀器的分辨能力保持高度準(zhǔn)確將被分析物與基質(zhì)干擾的區(qū)分至關(guān)重要5。通過(guò)進(jìn)行一系列重復(fù)進(jìn)樣分析（n = 10）我們對(duì)所有 132 種農(nóng)藥檢測(cè)的質(zhì)量準(zhǔn)確度在 5 ng/g（或 10 ng/g，具體根據(jù)化合物確定）濃度水平進(jìn)行了評(píng)估。沒(méi)有任何被分析物的質(zhì)量偏差值超過(guò) 1 ppm，整體質(zhì)量準(zhǔn)確度的平均值為 0.4 ppm, 為檢測(cè)的準(zhǔn)確度和選擇性提供最大信心保障（圖 7）。

 

 

圖 7. 嬰兒食品樣品中鑒定出的農(nóng)藥在 5（或 10） ng/g 濃度水平的準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)定結(jié)果（n = 10 的平均值）。

 

我們還在 0.5–100 ng/g （有些被分析物為 1–200 ng/g）濃度范圍內(nèi)評(píng)估了定量響應(yīng)的線性程度，樣品為進(jìn)行過(guò)基質(zhì)匹配的校準(zhǔn)標(biāo)樣，每個(gè)濃度水平進(jìn)行 3 次平行進(jìn)樣。在所有情況下，決定系數(shù)（R2） 均 > 0.99，平均值為 R2 = 0.997， 漸近線的回歸殘差 < 25%�；�合物線性擬合的樣例參見(jiàn)圖 8。

 

* 即便是在進(jìn)行快速 GC 分離的情況下，Q Exactive GC 系統(tǒng)能夠?yàn)榇笠?guī)模農(nóng)殘分析在全掃模式下提供高定量分析表現(xiàn)。

* 本系統(tǒng)的高速掃描、高分辨能力、出眾的質(zhì)量精度、以及全掃描模式下的靈敏度幫助分析人員在極低水平下實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、可重復(fù)農(nóng)藥定量分析。

* 以 60,000 FWHM（m/z 200）的常規(guī)質(zhì)量分辨率進(jìn)行數(shù)據(jù)采集能夠消除同質(zhì)量化合物的干擾，提高在復(fù)雜基質(zhì)中篩查農(nóng)藥的結(jié)果可信度。對(duì)所有化合物都持續(xù)保證亞 ppm 水平的質(zhì)量精度，確保化合物鑒定結(jié)果可信。

* Q Exactive GC 系統(tǒng)的定量表現(xiàn)足以匹敵 GC 三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)。

* Thermo Scientific TraceFinder 軟件使得分析人員能夠快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行高通量篩查和定量分析。

 

 

圖 8. 普硫松和苯霜靈在 0.5–100 ng/g 濃度區(qū)間內(nèi)的決定系數(shù)（左）和回歸殘差（%RSD）。

 

1. Commission Regulation (EU) No 396/2005 on maximum residue levels of pesticides in or on food and feed of plant and animal origin and amending Council Directive 91/414/EC, 16.3.2005, p. 1–16.

2. SANCO/12571/2013 (2014), Guidance document on analytical quality control and validation procedures for pesticide residues analysis in food and feed, 19.11.2013 rev.0.

3. Commission Directive (EU) No 2003/13/EC amending Council Directive 96/EC on processed cereal-based and baby foods for infants and young children, 14.2.2003, p.33-36.

4. Thermo Scientific Application Note 10432: Three-Fold Increase in Productivity for Pesticide Residue Analysis in Baby Food Using Fast Triple Quadrupole GC-MS/MS.

Runcorn, U.K. [Online] http://www.thermoscientific.com/ content/dam/tfs/ATG/CMD/cmd-documents/sci-res/app/ms/GC-MS/AN-10432-GC-MS-Pesticides-Baby-Food-AN10432-EN.pdf (accessed Apr. 3, 2015).

5. Thermo Scientific Technical Note 10455: High Mass Resolution is Essential for Confident Compound Detection.

Runcorn, U.K. [Online].

 

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