抗體的非特異性結(jié)合

更換封閉液（例如，使用酪蛋白替代BSA）；封閉結(jié)束后不要清洗；倒出封閉液，吸水紙上吸干殘留液體后直接進(jìn)行下一步。

未充分清洗酶標(biāo)板

確保在清洗過程中每個微孔都充滿緩沖液、清洗儀器正常工作。各步驟之間清洗3~5次，不要增加清洗次數(shù)。清洗完成后，將酶標(biāo)板用力按壓在紙巾上，以除去殘余的緩沖液。清洗溶液中應(yīng)添加適量的Tween-20（推薦濃度0.01-0.1%）。

緩沖液被污染

緩沖液應(yīng)新鮮配制，一周內(nèi)使用，并過濾除菌。

孵育溫度太高

整個實驗過程應(yīng)在室溫25℃。

孵育時間過長

縮短孵育時間

酶標(biāo)記物污染了底物或者陽性對照污染了微孔

吸取不同的試劑時應(yīng)更換吸頭，并使用不同的貯液器。最好用移液器加入或去除清洗緩沖液（倒入/倒出可能導(dǎo)致交叉污染）。

檢測抗體或Avidin-HRP的濃度過高

檢測濃度計算是否正確，或者進(jìn)一步稀釋后再使用。

底物在使用前曝光

在將底物加入到微孔中以前，應(yīng)始終避光保存

讀取吸光值時使用了錯誤的濾光片

ABTS為底物時應(yīng)在405nm波長讀取吸光值（TMB為底物時應(yīng)在450nm波長讀取吸光值），并以650nm作為校正波長。

顯色時間過長

每5分鐘讀取一次吸光值，以監(jiān)測空白孔的O.D.讀數(shù)。

 

遺漏了某種試劑或某個步驟

查看實驗方案，嚴(yán)格遵循實驗操作步驟。

清洗緩沖液中的去污劑濃度過高

去除或降低去污劑的濃度，推薦0.01-0.1%

酶標(biāo)板未適當(dāng)清洗

減少各步驟之間的清洗次數(shù)，尤其是當(dāng)未使用全自動或半自動洗板機(jī)時，清洗1-2次即可。

樣本中存在酶抑制劑

疊氮鈉抑制了過氧化物酶的活性。

孵育時間或溫度錯誤

孵育期間應(yīng)將酶標(biāo)板放在孵育箱（25℃）內(nèi)，以免出現(xiàn)溫度波動

加入微孔中的底物量有誤

檢查移液器

酶-底物系統(tǒng)不合適

Avidin-HRP和ABTS配對使用，Streptavidin和TMB配對使用

試劑盒內(nèi)的組分儲存不當(dāng)

按說明書要求儲存各組分

讀取吸光值時使用了錯誤的濾光片

ABTS為底物時應(yīng)在405nm波長讀取吸光值（TMB為底物時應(yīng)在450nm波長讀取吸光值），并以650nm作為校正波長

 

標(biāo)準(zhǔn)品配制有誤

使用推薦的稀釋緩沖液對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋

過早稀釋

使用前再配制各種試劑，并盡快使用

捕獲抗體無法包被

使用適合做ELISA的板，不能用細(xì)胞培養(yǎng)板

清洗不充分

每個微孔中應(yīng)加入等體積清洗液，確保所有微孔均可被抽吸干凈，并及時填充。

移液出錯

校正移液器，快速、等量的將移液器中的試劑沿微孔的側(cè)壁加入

顯色時間過長

空白孔的O.D.讀數(shù)不超過0.2或最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔的O.D.讀數(shù)不超過1.2。

試劑盒內(nèi)的組分儲存不當(dāng)

按說明書要求儲存各組分，不要將重懸后的試劑在室溫放置時間過長。

 

試劑混合不充分

移液前，充分混合試劑

清洗不充分

每個微孔中應(yīng)加入等體積清洗液，確保所有微孔均可被抽吸干凈，并及時填充。

移液出錯

校正移液器，快速、等量的將移液器中的試劑沿微孔的側(cè)壁加入

耗材重復(fù)使用

吸取不同樣本時應(yīng)更換吸頭；不同的試劑使用不同的貯液器；個孵育時段內(nèi)應(yīng)用新的密封片封板。

微孔被吸頭或洗板機(jī)劃傷

吸液、加液時小心操作

樣本中存在沉淀物

使用前應(yīng)離心樣本管

微孔不干凈或存在污垢

使用前仔細(xì)檢查微孔，并清除污垢。讀取吸光值前，請擦拭酶標(biāo)板的底部，以去除污垢或指紋。

 

蒸發(fā)

每個孵育步驟都應(yīng)使用密封片封板

溫度不均勻

孵育期間應(yīng)將酶標(biāo)板放在孵育箱（25℃）內(nèi)，以免溫度波動，請勿堆疊酶標(biāo)板。