微生物環(huán)境基因組學(xué)又叫宏基因組學(xué)，它是研究某一環(huán)境樣品中所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落多樣性的一門科學(xué)，它是一種研究微生物多樣性、開(kāi)發(fā)新的生理活性物質(zhì)（或獲得新基因）的新理念和新方法。

 

第二代高通量測(cè)序技術(shù)為研究微生物群落結(jié)構(gòu)提供了新的技術(shù)平臺(tái)，并得到越來(lái)越多的應(yīng)用和認(rèn)可。與傳統(tǒng)的微生物平板純培養(yǎng)方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印記雜交、定量PCR、基因芯片等分子生物學(xué)方法相比，具有如下優(yōu)勢(shì)：（1）不需要對(duì)微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)和純化，因此該方法不受微生物人工培養(yǎng)特性的限制，(2) 能同時(shí)對(duì)樣品中的優(yōu)勢(shì)物種、稀有物種及一些未知的物種進(jìn)行檢測(cè)，獲得樣品中的微生物群落組成，（3）并且在文庫(kù)制備過(guò)程中，可以通過(guò)嚴(yán)格的技術(shù)手段將文庫(kù)制備過(guò)程所帶來(lái)的偏向性降至最低，所以應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)能準(zhǔn)確地反映不同微生物間的相對(duì)豐度，（4）靈敏地探測(cè)出環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)隨外界環(huán)境的改變而發(fā)生的極其微弱的變化，（5）成本相對(duì)較低。

 

 

送樣->核酸提取->PCR擴(kuò)增->回收純化->文庫(kù)構(gòu)建->高通量測(cè)序->數(shù)據(jù)分析->報(bào)告

 

（1）PCR過(guò)程采用高保真酶以保證擴(kuò)增的高保真、高效性以及無(wú)偏向性。

（2）標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作流程和嚴(yán)格的質(zhì)量控制體系。

（3）Q30比例>80%。

（4）專業(yè)的生物信息學(xué)分析能力，深入發(fā)掘數(shù)據(jù)的生物學(xué)意義。

 

 

（1）片段長(zhǎng)度分布圖

有效序列：根據(jù)樣品barcode（標(biāo)簽序列）提取有效測(cè)序，序列中含有特異性擴(kuò)增引物序列，長(zhǎng)度大于可供分析標(biāo)準(zhǔn)的序列稱為有效序列。樣品的目標(biāo)區(qū)域16S rRNA的V4區(qū)的平均期望長(zhǎng)度為292bp。雙端測(cè)序正反向讀取的序列總長(zhǎng)為600bp，扣除分子標(biāo)記24bp，共有576bp。雙端讀序列正確拼接且長(zhǎng)度在242bp至342bp之間的序列被確定為有效序列。

 

所有樣本的有效序列長(zhǎng)度分布圖如下：

其中占比最多的五種長(zhǎng)度及其百分比分別為：292(96.51%)，291(2.81%)，290(0.57%)，293(0.09%)，294(0.01%)，其余長(zhǎng)度占比為0.01%。

 

（2）Alpha多樣性曲線

根據(jù)OTU數(shù)據(jù)，可以做出每個(gè)樣品的（OTU相似水平為97%的）稀釋曲線。樣品的稀釋曲線如下圖所示（詳細(xì)信息見(jiàn)rarefaction_plots.html）：

 

（3）Beta多樣性曲線

物種累積曲線（Species Accumulation Curve）分析

物種累積曲線（species accumulation curves）用于描述隨著抽樣量的加大物種增加的狀況，是理解調(diào)查樣品的物種組成和預(yù)測(cè)物種豐富度的有效工具，在生物多樣性和群落調(diào)查中，被廣泛用于抽樣量充分性的判斷以及物種豐富度（species richness）的估計(jì)。因此，通過(guò)物種累積曲線不僅可以判斷抽樣量是否充分，在抽樣量充分的前提下，運(yùn)用物種累積曲線還可以對(duì)物種豐富度進(jìn)行預(yù)測(cè)。

 

（4）OTU比較venn圖

選擇不多于五個(gè)樣品的一組，分析樣品間OTU重合情況，將結(jié)果以VENN圖形式展示如下：

 

（5） PCA分析

 

（6） 群落結(jié)構(gòu)組分圖（共1組分析）

選定一個(gè)或多個(gè)需要分析的樣品，選定一個(gè)分類學(xué)水平，按照相應(yīng)多樣性信息作圖，反映各樣品的群落結(jié)構(gòu)�？蛇x分類學(xué)水平：門、綱、目、科、屬；同一組樣品選擇多個(gè)分類學(xué)水平為多組分析。  

 

（7） 常規(guī)Heatmap圖

選擇多個(gè)樣品，作出其在選定的分類學(xué)水平上群落結(jié)構(gòu)Heatmap圖。可選分類學(xué)水平：門、綱、目、科、屬、OTU（97%）。如分析單元數(shù)目較多，默認(rèn)使用占比較超過(guò)1%的種屬或OTU作圖。