介紹

在生物實(shí)驗(yàn)中要經(jīng)常要使用到的平行線分析（PLA）方法，當(dāng)無法直接檢測(cè)一個(gè)生物制品的活性而只能通過檢測(cè)其產(chǎn)生的效果時(shí)，PLA方法通常會(huì)被用來進(jìn)行效應(yīng)曲線的比較來獲得此制品的效果（Figure1）。如果對(duì)于兩種物質(zhì)其生物響應(yīng)相似或者在兩種不同的生物環(huán)境中同一種物質(zhì)產(chǎn)生相似的效應(yīng)曲線時(shí)，平行線分析法可以被用來進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)平行性是計(jì)算化合物或藥物相對(duì)活性的前提，并且在很多生物應(yīng)用中如藥物活性比較、分析物鑒定、交叉反應(yīng)、干擾物質(zhì)、基質(zhì)補(bǔ)償、濃度估算和抑制效應(yīng)等應(yīng)用研究中。

當(dāng)兩條曲線被判定為平行時(shí)，其中一條曲線的函數(shù)可以通過通過另一條曲線的函數(shù)乘上一個(gè)比例系數(shù)向X軸的左邊或右邊變換獲得：ƒ(x) = ƒ(rx), 其中x是劑量，r是比例系數(shù)或相對(duì)活性。對(duì)于相對(duì)活性，一般將參考品（已知品）的活性設(shè)為1，可以使用一個(gè)比例系數(shù)可以將參考品的曲線變換為測(cè)試品（未知品）曲線，那么這比例系數(shù)則被稱之為測(cè)試品的相對(duì)活性。這個(gè)方法應(yīng)用于線性擬合的曲線非常合適，因?yàn)榫�性擬合的曲線在整個(gè)濃度范圍內(nèi)的曲線斜率是保持一致的（Figure2）�？墒菍�(duì)于非線性擬合曲線如4-參數(shù)和5-參數(shù)曲線，S形的濃度效應(yīng)曲線在整個(gè)測(cè)試濃度范圍內(nèi)具有變?cè)挼男甭手担‵igure1）。

用于評(píng)價(jià)平行性的方法根據(jù)平行性假設(shè)的驗(yàn)證方法不同大致可以分為兩大類：效應(yīng)比較法和參數(shù)比較法。本文將對(duì)這兩大類方法進(jìn)行詳細(xì)解釋和介紹怎樣使用SoftMax® Pro 7軟件進(jìn)行平行性測(cè)試。我們建立了一個(gè)Protocol包括了使用F-檢驗(yàn)進(jìn)行F-檢驗(yàn)概率測(cè)試和使用卡芳-檢驗(yàn)進(jìn)行卡芳概率測(cè)試。另外，對(duì)于參數(shù)比較法，根據(jù)菲勒定理我們也建立了一個(gè)Parallelism Test 的protocol放在SoftMax Pro Protocol的庫(kù)內(nèi)。所有這些方法都可以被用于評(píng)價(jià)線性和非線性擬合曲線。

Figure 1. 使用約束型通用4參數(shù)曲線擬合進(jìn)行效應(yīng)曲線的平行線分析。

Figure 2. 線性回歸平行線模型。參考曲線的相對(duì)活性（紅色圈）設(shè)為1，用來變換參考曲線為測(cè)試曲線（藍(lán)色圈）使用的校正因子即是未知品的相對(duì)活性。

平行性檢測(cè)

效應(yīng)比較法

生物系統(tǒng)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)不符合預(yù)期的現(xiàn)象，并且數(shù)據(jù)會(huì)出現(xiàn)一些噪聲和波動(dòng)；因此，選擇正確的曲線擬合方式和權(quán)重因子，來消除這些噪聲和波動(dòng)是進(jìn)行平行性評(píng)價(jià)前的首要一步。如果選擇了一個(gè)不合適的擬合方式，那么可能在平行性評(píng)價(jià)系統(tǒng)內(nèi)引入偏差，進(jìn)而得出錯(cuò)誤的結(jié)論。

由于根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)，很難獲得完全平行的擬合曲線，尤其對(duì)于非線性擬合回歸，而計(jì)算非平行曲線獲得相對(duì)活性是很困難的。在效應(yīng)比較法中，參考品和測(cè)試品的曲線會(huì)使用約束模型同時(shí)進(jìn)行擬合，在這個(gè)模型中，曲線被強(qiáng)制變?yōu)槠叫�；而在非約束模型中，兩條曲線會(huì)各自進(jìn)行擬合。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法，來比較約束模型和非約束模型兩種擬合度的差異，這個(gè)差異可能是由于非平行性造成的。

在約束模型中，用來描述曲線的所有參數(shù)都是一樣的，除了用來描述X-值的參數(shù)不一樣；線性擬合中，X-值是指截距，非線性擬合中是指上、下漸近線之間的中值，也就是EC50值。SoftMax Pro軟件具有計(jì)算線性擬合的相對(duì)活性，也可以使用約束性模型（全局?jǐn)M合模型）和獨(dú)立模型對(duì)非線性擬合曲線進(jìn)行評(píng)價(jià)和計(jì)算相對(duì)活性。

虛假設(shè)測(cè)試

在效應(yīng)比較法中，平行性的計(jì)算通常是利用殘差平方和（RSSE）的函數(shù)來進(jìn)行的,以此來判斷約束性模型對(duì)數(shù)據(jù)的擬合效果，另外一個(gè)特殊的方法，則是根據(jù)附加平方和的分析來進(jìn)行。這個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)回歸方法是方差分析(ANOVA)的一種形式，其中虛假設(shè)的是約束性模型是正確的或者說曲線是相互平行的。虛假設(shè)的驗(yàn)證，可以使用各種不同的統(tǒng)計(jì)學(xué)技術(shù)，包括概率的F-檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)。在這兩種方法中，概率值會(huì)被計(jì)算出來，通常這個(gè)值介于0-1之間，當(dāng)這個(gè)值接近1時(shí)，意味著曲線間的平行性在增大。需要注意的是，F(xiàn)-檢驗(yàn)是有一定缺陷的，此法對(duì)于對(duì)獨(dú)立模型擬合度很高的曲線可能產(chǎn)生假陽(yáng)性判斷或者對(duì)于獨(dú)立模型擬合度很低的曲線產(chǎn)生假陰性的判斷。這兩種方法都被收錄進(jìn)了SoftMax Pro軟件當(dāng)中，檢驗(yàn)值和概率值計(jì)算可以通過軟件內(nèi)的以下公式方便的獲得：

• ChiSquaredPLA (PlotName@GraphName): Returns the value of the chi-squared statistic for a reduced curve fit. 返回被擬合曲線的卡芳統(tǒng)計(jì)值

• ChiProbabilityPLA (PlotName@GraphSection): Returns the chi-squared probability distribution value for a reduced curve fit.返回被擬合曲線的卡芳統(tǒng)計(jì)值概率分布值

• FStatPLA(PlotName@GraphSection): Returns the value of the F-test statistic for a reduced curve fit.

返回被擬合曲線的F-檢驗(yàn)值

• FProbPLA(PlotName@GraphSection): Returns the value of the F-test probability for a reduced curve fit.

返回被擬合曲線的F-檢驗(yàn)值概率分布值

注：以上所有公式只有在曲線擬合選項(xiàng)設(shè)置中的Global Fit (PLA)選項(xiàng)被使用的情況下才可以使用。PlotName@GraphName是曲線的全稱，包含圖表的名稱，例如，Plot#1@Graph#1或Std@Standardcurve。指定某一條曲線作為公式內(nèi)曲線是帶有主觀性的，實(shí)際上卡方值是從該圖表中的所有曲線數(shù)據(jù)計(jì)算而來的。

名稱為“Parallel Line Analysis Using F-test and Chi-squared Test”的模板，是根據(jù)這兩種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法而建立的SMP模板。當(dāng)使用儀器直接獲取到數(shù)據(jù)或者從外部導(dǎo)入數(shù)據(jù)到模板中后，所有的計(jì)算過程會(huì)自動(dòng)進(jìn)行，并進(jìn)行零假設(shè)的評(píng)估，判斷曲線是否平行。

在這個(gè)模板中，F(xiàn)-檢驗(yàn)和卡芳檢驗(yàn)的概率值必須大于等于0.95才能認(rèn)定曲線是平行的。一般來說，這個(gè)設(shè)置的意思是指有95%的置信度該假設(shè)是成立的。置信程度是可以被調(diào)整的以適應(yīng)不同實(shí)驗(yàn)的接受水平。

噪聲和權(quán)重

噪聲是指檢測(cè)響應(yīng)的隨機(jī)變化，當(dāng)進(jìn)行平行線評(píng)價(jià)時(shí)這是需要考慮的重要因素，因?yàn)樗鼤?huì)影響檢測(cè)平行性的能力。在高噪聲的情況下，平行性計(jì)算值由于由于受噪聲的影響過大，因此無法再正確的反應(yīng)非平行性的程度。

對(duì)于F-檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)法這兩種方法，在計(jì)算各自的概率值的過程中對(duì)于不同噪聲水平的處理能力是不同的。F-檢驗(yàn)的概率值不受此因素影響，但是卡芳檢驗(yàn)概率計(jì)算值則高度依賴于噪聲水平并要求對(duì)于數(shù)據(jù)方差進(jìn)行準(zhǔn)確的估算。因此，對(duì)于卡方檢驗(yàn)法需要進(jìn)行反方差權(quán)重設(shè)置。

如在“Selecting the best weighting factor in SoftMax Pro 7”此篇應(yīng)用資料里討論的，生物實(shí)驗(yàn)一般在在曲線的上半部分會(huì)有較大的方差。在無權(quán)重的回歸分析中，平行性的結(jié)果會(huì)主要受曲線的上半部分的數(shù)據(jù)點(diǎn)影響，而曲線的下半部分的數(shù)據(jù)點(diǎn)在對(duì)于平行性結(jié)果的影響不大。

在軟件的模板中，權(quán)重因子的設(shè)置使用方差的倒數(shù)，但是根據(jù)情況可以調(diào)整為更合適的權(quán)重公式。另外，在SoftMax Pro 6.5或更高版本中，可以直接進(jìn)行方差的倒數(shù)權(quán)重項(xiàng)的設(shè)置(Figure 4G)�？ǚ綑z驗(yàn)方法中，參數(shù)的置信區(qū)間設(shè)置項(xiàng)(Figure 4H)只有在‘Weights are Inverse Variances’項(xiàng)被選擇的情況下才能使用。最佳的權(quán)重因子的設(shè)置會(huì)保證結(jié)果是主要來源于所有變化的數(shù)據(jù)點(diǎn)。

如何在SoftMax Pro使用PLA

在SoftMax Pro 7軟件中，PLA可以在除了“point-to-point“, ”log-logit“ 和 ”cubic spline“三種擬合方式之外的所有通用曲線擬合方式下使用。在圖表部分，所有曲線具有一個(gè)共同的曲線擬合方程，PLA的具體使用設(shè)置請(qǐng)見Figure 4。

參數(shù)比較法

與響應(yīng)比較法直接評(píng)價(jià)不同劑量曲線下的響應(yīng)差異不同，參數(shù)比較法會(huì)各自獨(dú)立地對(duì)非約束模型下的各個(gè)曲線的參數(shù)進(jìn)行比較，并參考大概置信區(qū)間；參數(shù)對(duì)必須落在規(guī)定置信水平下的置信區(qū)間內(nèi)。這種方法叫做等效測(cè)試和平行性小于規(guī)定閾值的測(cè)試法。歐洲藥典中使用的斜率比值法就是等效測(cè)試法的一個(gè)例子。

菲勒定理

菲勒定理使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算兩個(gè)參數(shù)比值的置信區(qū)間，使用tInv 函數(shù)進(jìn)行比值的計(jì)算，因此遵循帶自由度的t-分布，其概率為p。SoftMax Pro軟件的統(tǒng)計(jì)學(xué)公式，可以計(jì)算參考曲線和測(cè)試曲線各自曲線擬合參數(shù)之間比值的置信區(qū)間，并建立了一個(gè)模板(Figure 5)包含了這些計(jì)算和概率閾值設(shè)定0.1（90%置信度），可做相應(yīng)調(diào)整。為了判定參考曲線和測(cè)試曲線之間是否平行，需要將計(jì)算的置信區(qū)間與一定置信水平的固定置信區(qū)間進(jìn)行比較；在此模板中，使用90%的置信水平，因此，計(jì)算的置信區(qū)間如果落在0.9~1.1之間，那么這兩曲線將被認(rèn)定為平行。

對(duì)于線性擬合曲線，該測(cè)試會(huì)針對(duì)參考曲線和測(cè)試曲線的斜率值進(jìn)行，也即SoftMax Pro軟件中所描述的曲線方程內(nèi)的B參數(shù)值�？墒�，對(duì)于非線性擬合曲線，此方法只測(cè)試上平臺(tái)和斜率值，下平臺(tái)則由于菲勒定理的數(shù)學(xué)局限而不做測(cè)試。在低濃度時(shí)，參數(shù)的變異會(huì)非常高，導(dǎo)致中間計(jì)算過程會(huì)產(chǎn)生虛數(shù)，進(jìn)而導(dǎo)致最終計(jì)算的置信區(qū)間不正確或無法計(jì)算。這個(gè)問題被美國(guó)農(nóng)業(yè)部（USDA）的獸用生物制品中心建議將下平臺(tái)值固定為0，然后使用上平臺(tái)和斜率值來進(jìn)行測(cè)試。相同地，SoftMax Pro 軟件的Parallelism Test的模板內(nèi)，默認(rèn)將下平臺(tái)值設(shè)為0，然后對(duì)斜率（參數(shù)B）和作為上平臺(tái)的參數(shù)A或D進(jìn)行平行性結(jié)論的判斷。

Figure 3. 非線性回歸的平行線模型。相對(duì)活性的計(jì)算由曲線的線性區(qū)段的半效劑量效應(yīng)EC50獲得，曲線使用約束性模型進(jìn)行擬合，除了描述X-軸的參數(shù)外，各條曲線的4參數(shù)方程中的各個(gè)參數(shù)都是相同的。

Figure 4.如何在SoftMax Pro軟件中應(yīng)用PLA和進(jìn)行相對(duì)活性計(jì)算。選擇一個(gè)包含多個(gè)曲線的圖表，點(diǎn)擊home欄圖表工具中的曲線擬合設(shè)置項(xiàng)（A）；或者在圖表部分的上部的工具了項(xiàng)（B）；在曲線擬合項(xiàng)對(duì)話框內(nèi)選擇GlobalFit（PLA）項(xiàng)（C）；在擬合下拉菜單內(nèi)選擇除point-to-point, log-logit, 和cubic spline 三種擬合方式之外的任何擬合方式（D）；選擇一條曲線作為參考曲線（E）；如有必要的話，選擇相應(yīng)的擬合參數(shù)和相對(duì)活性的置信區(qū)間（F）；如有必要，選擇相應(yīng)的權(quán)重項(xiàng)，請(qǐng)參考“Selecting the best weighting factorin SoftMax Pro 7”中的關(guān)于如何在SoftMax Pro V版本6.5或更高版本中選擇方差倒數(shù)作為權(quán)重因子的設(shè)置方法（G）；如有必要，選擇統(tǒng)計(jì)學(xué)工具按鈕（H）；當(dāng)所有曲線選項(xiàng)設(shè)置好后，點(diǎn)擊OK按鈕，曲線會(huì)自動(dòng)被擬合到約束型模型中，除了描述X軸的參數(shù)外，描述各條曲線的參數(shù)是相同的如Figure 3.對(duì)于非線性擬合函數(shù)，所有曲線的最小和最大響應(yīng)值（下平臺(tái)和上平臺(tái)值）也被約束為相同的值。

Figure 5. 在SoftMax Pro 7軟件中使用效應(yīng)比較法進(jìn)行平行性評(píng)價(jià)。初始的置信水平和概率分別設(shè)置為90%和0.1，但是可以根據(jù)情況做相應(yīng)調(diào)整。當(dāng)在此置信區(qū)間內(nèi)參數(shù)比值的低值（rBCILower和rDCILower）和高值(rBCIUpper 和 rDCIUpper)分別被計(jì)算出來后，會(huì)被拿來與定義的置信區(qū)間標(biāo)準(zhǔn)值(lval 和 uval)進(jìn)行比較，如果計(jì)算出來的置信區(qū)間值坐落在定義的置信區(qū)間范圍內(nèi)，則認(rèn)為參考曲線和測(cè)試曲線是相互平行的關(guān)系。