參益安神片對(duì)改善小鼠學(xué)習(xí)記憶的作用及其機(jī)制

參益安神片是在參茂五味子片川的基礎(chǔ)上，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道按照中醫(yī)理論設(shè)計(jì)而成的處方，由人參、五味子、酸棗仁、益智四種中藥材組成。人參和益智仁為益智安神的常用藥，酸棗仁具有養(yǎng)心安神、斂汗的功效，它不僅是治療失眠不寐之藥，還能滋補(bǔ)強(qiáng)壯，久服能養(yǎng)心健腦;加用五味子，有酸斂收澀、益氣生津等功效，善治心腎兩經(jīng)的虛虧或不調(diào)引起的心神不安、涼悸失眠等。但復(fù)方制劑是否具有明顯的改善記憶、鎮(zhèn)靜催眠的作用未見報(bào)道。本文主要對(duì)復(fù)方制劑參益安神片改善記憶作用進(jìn)行藥效學(xué)研究，并探討其作用機(jī)制。

1材料與方法

1. 1實(shí)驗(yàn)藥品及試劑復(fù)方制劑參益安神片，自制。含生藥量29/片(所需藥材均購于長(zhǎng)春市宏檢大藥房);棗東安神顆粒(北京優(yōu)你特藥業(yè)有限公司)批號(hào):130501;實(shí)驗(yàn)所需藥物均以蒸餾水配制所需濃度。酸性正丁醇、正庚烷、鄰苯二甲醛七鹽酸溶液、碘試液、半膚氨酸溶液、pH7. 2的磷酸鹽緩沖液(PBS)、乙二胺四乙酸(EDTA)試液。

1. 2動(dòng)物健康昆明鼠種(KM),18-22g，雌雄各半，購于吉太小動(dòng)物用品經(jīng)銷處:受試小鼠引進(jìn)后置于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。溫度: 20士3攝氏度，相對(duì)濕度:50%一70% 。

1. 3實(shí)驗(yàn)儀器：AL 204萬分之一天平(梅特勒刊毛利多儀器(上海)有限公司);CaryEc;lip、分子熒光光度計(jì)(鄭州中譜儀器設(shè)備有限公司)8205恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司);T18 basic:組織勻漿儀(廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司);KQ3200DB數(shù)控超聲清洗器(廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司);XR-3TB型跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(); XR-XB110小鼠避暗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司);Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司)。

1. 4方法將50只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組、高劑量組(1. 606 5 g / kg)、中劑量組(0.535 5 g/kg)、低劑量組(0.267 8 g/kg) ,3個(gè)劑量組分別灌胃給藥參益安神片，空白對(duì)照組給予等量生理鹽水，陽性對(duì)照組給予棗東安神顆粒，灌胃巧15d后，開始對(duì)各組小鼠進(jìn)行訓(xùn)練并測(cè)定。

1. 4. 1跳臺(tái)試驗(yàn)：分別將小鼠放在絕緣平臺(tái)上(計(jì)時(shí)開始)。記錄第2次跳下平臺(tái)的潛伏期、3min內(nèi)的跳下平臺(tái)的錯(cuò)誤次數(shù)和各組跳下平臺(tái)的動(dòng)物數(shù)。訓(xùn)練3d后開始測(cè)試。

1.4.2避暗實(shí)驗(yàn)：將小鼠置于電擊室，背對(duì)洞口，先給予條件刺激(燈光)15 s，在亮燈10s后開始通電5 s(電擊強(qiáng)度為40 V,50 Hz)。記錄每只小鼠進(jìn)入暗室的潛伏期、5、min內(nèi)進(jìn)入暗室錯(cuò)誤的次數(shù)和各組進(jìn)入暗室的動(dòng)物數(shù)。并訓(xùn)一算5 min內(nèi)進(jìn)入暗室(錯(cuò)誤反應(yīng))的百分率，訓(xùn)練5d后開始測(cè)試。

1.4.3水迷宮實(shí)驗(yàn)從訓(xùn)練第1天開始，每批實(shí)驗(yàn)各有1只小鼠給藥，平行操作，5min后再給第二批小鼠注射，以此類推。每天訓(xùn)練4次，每次隨機(jī)選擇一個(gè)入水點(diǎn)，觀察并記錄小鼠尋找并爬上平臺(tái)的路線圖及所需時(shí)間(潛伏期)。4次訓(xùn)練小鼠分別從4個(gè)不同的入水點(diǎn)入水，如果小鼠在120s內(nèi)未找到平臺(tái)，需將其引至平臺(tái)。這時(shí)潛伏期計(jì)為120 s，每次訓(xùn)練間隔

60 s，以4次的平均時(shí)間及路程作為每天的訓(xùn)練成績(jī)，連續(xù)訓(xùn)練5d后開始測(cè)定。

1.4.4復(fù)萬制劑參益安神片對(duì)小鼠靦腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(NE）、多巴胺(DA） ,5—羥色胺(5 -HT)的影響。

1.4.4.1腦組織NE含量測(cè)定上述實(shí)驗(yàn)小鼠50只，斷頭取腦，將腦組織用冰生理鹽水清洗后吸干水分，天平稱取小鼠大腦重量，將小鼠大腦沿腦中線切開，取左半腦組織加入2 ml酸

勝正丁醇后勻漿，2 500   r/min離心5  min，分別取上清液0. 4 ml，加正庚烷0. 8 ml，加0. 1 mol/L的HCl 0. 2 ml超聲1 min，2 500 r/min離心5 min分別取底層水相。水相50 ul，加PBS 150ul,加EDTA 40ul，加新配制的碘液20ul,混勻，靜置3  min，分別加堿性磷酸鈉40閃，混勻，靜置3  min，分別加醋酸40 ul,混勻，80℃水浴10 min，冷卻即得。吸取各樣品200 ul ，置96孔板內(nèi)，進(jìn)行含量測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)382/4880

1.4.4.2腦組織中DA的含量測(cè)定上述實(shí)驗(yàn)小鼠50只，斷頭取腦，將腦組織用冰生理鹽水清洗后吸干水分，天平稱取小鼠大腦重量，將小鼠大腦沿腦中線切開，去左半腦組織加入2 ml酸性正丁醇后勻漿，分別取上清液0. 4 ml，加正庚烷0. 8 ml，加0. 1 mol/L的HCl 0. 2 ml超聲1 min，2 500 r/min離心5  min分別取底層水相。水相50 ul，加PBS 150 },1加EDTA

40閃，加新配制的碘液20閃，混勻，靜置3  min，分別加堿性磷酸鈉40 ul,混勻，靜置3  min，分別加5 mol/L醋酸40 ul,混勻，100℃水浴15 min，冷卻即得。精密吸取各樣品200 ul ，置96孔板內(nèi)，進(jìn)行含量測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)為325 /385。記錄結(jié)果。

1.4.4.3腦組織中5 -HT的含量測(cè)定上述實(shí)驗(yàn)小鼠50只，斷頭取腦，將腦組織用冰生理鹽水清洗后吸干水分，天平稱取小鼠大腦重量，將小鼠大腦沿腦中線切開，去左半腦組織加入

2 ml酸性正丁醇后勻漿，分別取上清液0. 4 ml，加正庚烷0. 8 ml，加0. 1 mol/L的HCl 0. 2 ml超聲1 min，2 500 r/min離心5  min分別取底層水相。取水相0. 4 ml，加入0. 25%半膚氨

酸(新配)0. 1 ml，再加入0. 002% OPTO NHCI 3 mlo混勻，沸水浴10 min，冷卻即得。精密吸取各樣品200閃置96孔板內(nèi)，進(jìn)行含量測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)為368 /480 0

2結(jié)果

2. 1復(fù)方制劑參益安神片跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性對(duì)照組、中劑量組潛伏期與錯(cuò)誤次數(shù)與空白對(duì)照組比較顯著差異(P<0.05或P<0. O1)，高劑量組潛伏期與錯(cuò)誤次數(shù)與空白對(duì)照組比較有極顯著性差異(P<0. O1)。

2. 2復(fù)萬制劑參益安神片邂暗買驗(yàn)結(jié)果中刑量組錯(cuò)誤次數(shù)與空白對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.05)，高劑量組、陽性對(duì)照組錯(cuò)誤次數(shù)與空白對(duì)照組比較有極顯著性差異(P<0. O1)，其他4組測(cè)試潛伏期與空白對(duì)照組比較均有增長(zhǎng)。

2. 3復(fù)方制劑參益安神片水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果中劑量組、高劑量組實(shí)驗(yàn)完成時(shí)間〔(69. 84士23. 37) e , X65. 45士22.98) e〕與空白對(duì)照組〔(114. 82士7.96) e〕比較差異顯著(P<0. O5)。陽性對(duì)照組為(101. 72士26. 32) e，低劑量組為(80. 50士27. 65) e o

2. 4小鼠腦內(nèi)單胺舉神纖涕質(zhì)測(cè)寧結(jié)吳見表2}高、中劑量組腦內(nèi)5-HT,DA,NE含量與空白對(duì)照組比較顯著增加(P<0. OS)，低劑量組與空白對(duì)照組比較均升高，但無顯著差異(P>0. OS )。

3討論

參益安神片選取了四味常用的中藥進(jìn)行配伍，通過避暗試驗(yàn)、跳臺(tái)試驗(yàn)、水迷宮試驗(yàn)可以看出無論是錯(cuò)誤次數(shù)還是潛伏期給藥組都有所改善，其藥效與陽性對(duì)照藥對(duì)比藥效相當(dāng)，因而從藥效學(xué)角度看來，參益安神片的改善學(xué)習(xí)記憶作用可以得到較充分的肯定，有較好的益智作用。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)包括兒茶胺和叫睬胺兩類，前者包括DA,NE和腎上腺素，后者為5-HT，大腦皮質(zhì)、紋狀體中存在大量的DA和5 -HT能神經(jīng)末梢，他們對(duì)高級(jí)活動(dòng)如感情、學(xué)習(xí)、記憶起重要作用。DA含量下降是腦功能衰老的表現(xiàn)之一，學(xué)習(xí)記憶增強(qiáng)常伴有NE,DA的增加，但對(duì)5 -HT的報(bào)道還不是特別明確。參益安神片片改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力可能與5-HT,DA,NE的相互調(diào)節(jié)有關(guān)。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道〔7〕，神經(jīng)中樞內(nèi)的DA代謝會(huì)影響NE的代謝，NE可能調(diào)節(jié)廣泛腦區(qū)的突觸傳入活動(dòng)，增大環(huán)境中有意義的信息傳入，而抑制其他傳入刺激的干擾，從而提高注意力，增強(qiáng)學(xué)習(xí)能力。

本實(shí)驗(yàn)采用熒光法對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的含量進(jìn)行測(cè)定用于研究改善記憶的作用機(jī)制，熒光法與液相色譜法進(jìn)行比較，熒光法實(shí)驗(yàn)?zāi)芴岣邔?shí)驗(yàn)效率，口前試劑盒的應(yīng)用也越來越廣泛，可以

在后續(xù)的機(jī)制研究試驗(yàn)中進(jìn)行優(yōu)選。