細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)新方法：可實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞動(dòng)態(tài)

細(xì)胞趨化性（Chemotaxis，亦被稱為化學(xué)趨向性）是趨向性的一種，指細(xì)胞、細(xì)菌及其他單細(xì)胞、多細(xì)胞生物依據(jù)環(huán)境中某些化學(xué)物質(zhì)而趨向的運(yùn)動(dòng)。趨化性對(duì)細(xì)胞的發(fā)展和其他正常功能一樣不可或缺。

在這里，我們以小鼠樹突狀細(xì)胞為例，介紹一個(gè)細(xì)胞的化學(xué)趨化實(shí)驗(yàn)。

一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：

儀器：

• 細(xì)胞培養(yǎng)箱（高濕度，37℃，5%CO2）
• 倒置顯微鏡，具有10X相差物鏡和定時(shí)拍照功能
• 鏡載加熱孵育系統(tǒng)（37℃，5%CO2）
• 可選配置：全自動(dòng)載物臺(tái)，自動(dòng)對(duì)焦系統(tǒng)
• 分析軟件：可選用手動(dòng)分析軟ImageJ的“Manual Tracking”模塊，或全自動(dòng)的ibidi提供的WimTaxis進(jìn)行細(xì)胞軌跡追蹤。最后使用ibidi公司的“Chemotaxis and Migration Tool” 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

樹突狀細(xì)胞：

實(shí)驗(yàn)前一天準(zhǔn)備工作：

為了減少ibidi細(xì)胞趨化載玻片與培養(yǎng)基中的氣泡，將載玻片和培養(yǎng)基提前24小時(shí)放入培養(yǎng)箱中

將8-10天的樹突狀細(xì)胞用200 ng/ml LPS 過夜處理（培養(yǎng)基等試劑見表一）

表一：細(xì)胞培養(yǎng)和活化所需的試劑盒培養(yǎng)基

*Lutz, M. B. et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods 223, 77–92 (1999)  

3.基質(zhì)膠制備，Collagen I，bovine，1.6mg/ml

樹突狀細(xì)胞的化學(xué)趨化實(shí)驗(yàn)所需的試劑如下：

表二：化學(xué)趨化需要的耗材和試劑

表三：制備1.6mg/ml 基質(zhì)膠

二、操作步驟：

• 使用表一中的培養(yǎng)基制備  9 x 106 cells/ml 的細(xì)胞懸液
• 在1.5ml離心管中小心混勻表三中的1和2號(hào)試劑，避免產(chǎn)生氣泡
• 在另一1.5ml離心管中準(zhǔn)備150 μl  collagen 
• 使用200μl槍頭從第二步的混合液中吸取30μl（圖一A）
• 小心混勻（圖一B），避免產(chǎn)生氣泡
• 加入90μl細(xì)胞懸液到上一步混合液中（圖一C）
• 小心混勻（圖一D），避免產(chǎn)生氣泡

圖一：制備細(xì)胞-基質(zhì)膠混合液圖示，注意：1）避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)破壞膠原纖維，不能使用Vortex；2）膠原混合后，離膠凝大約有5分鐘時(shí)間，如果在凝膠后再進(jìn)行操作會(huì)破壞膠原纖維；3）當(dāng)剛加10x MEM到NaHCO3中的時(shí)候會(huì)看到顏色變化，這表明沒有充分反應(yīng)，因此加入混合液到膠原蛋白中后要充分混勻。

細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)

趨化試劑

• 化學(xué)趨化物：CCL 19（1.25 μg/ml in RPMI 1640/10%FCS）
• 無化學(xué)趨化物培養(yǎng)基：RPMI1640，10%FCS

三、實(shí)驗(yàn)步驟

當(dāng)細(xì)胞-基質(zhì)膠混合液制備好后直接加入ibidi細(xì)胞趨化載玻片的中間通道中（圖二）

圖二，在觀測(cè)通道中加入細(xì)胞-基質(zhì)膠混合液

• 將細(xì)胞趨化載玻片放入培養(yǎng)箱中30-35分鐘，等待膠原蛋白凝固
• 膠凝固后，分別在兩邊儲(chǔ)液池中加入60μl的化學(xué)趨化物和無化學(xué)趨化物培養(yǎng)基作為細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)（+/-）（圖三）

圖三：加入化學(xué)趨化物（紅色）和無化學(xué)趨化物培養(yǎng)基（藍(lán)色）

在兩邊儲(chǔ)液池中均加入60μl的無化學(xué)趨化物培養(yǎng)基作為空白對(duì)照（-/-）（圖四）

圖四：加入無化學(xué)趨化物培養(yǎng)基（藍(lán)色）作為空白對(duì)照

• 按說明，將通道加液孔塞緊后可以進(jìn)行圖像采集
• 將載玻片置入鏡載加熱孵育系統(tǒng)中，調(diào)整好采集位點(diǎn)，進(jìn)行4小時(shí)的觀測(cè)，每2分鐘采集一張圖片

圖五：明場(chǎng)1小時(shí)處圖像采集，由于是3D培養(yǎng)環(huán)境，不是所有的細(xì)胞都能被清楚的成像。

圖像處理

手動(dòng)細(xì)胞軌跡追蹤

• 下載ImageJ，并安裝Manual Tracking模塊
• 導(dǎo)入采集的系列圖像到ImageJ中，打開模塊“Manual Tracking”，選擇“Add track”開始記錄細(xì)胞軌跡
• 選擇一個(gè)細(xì)胞，按照時(shí)間點(diǎn)單擊細(xì)胞，第一點(diǎn)擊后，會(huì)有新窗口跳出來顯示初始位置，以后每次點(diǎn)擊，都將在這個(gè)新窗口中產(chǎn)生一個(gè)該細(xì)胞隨著時(shí)間的新坐標(biāo)
• 統(tǒng)計(jì)完足夠的細(xì)胞軌跡后，保存軌跡坐標(biāo)表格
• 至少收集30個(gè)細(xì)胞的軌跡才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，避免同一細(xì)胞追蹤兩次，去除由于凋亡會(huì)而不能采集完整的軌跡的細(xì)胞
• 可以將“Overlay dots & lines”以.avi格式導(dǎo)出

2）全自動(dòng)細(xì)胞軌跡追蹤

使用ibidi的WimTaxis自動(dòng)分析平臺(tái)，將采集的系列圖像上傳到該平臺(tái)，幾個(gè)工作日后，會(huì)得到細(xì)胞軌跡的坐標(biāo)表格數(shù)據(jù)結(jié)果。

四、數(shù)據(jù)處理

使用遷移指數(shù)（ Forward Migration Indices*，F(xiàn)MIs）作為比較趨化實(shí)驗(yàn)和對(duì)照試驗(yàn)的參數(shù)。在有趨化物的情況下，空白對(duì)照的FMI和與趨化物垂直方向的化學(xué)趨化的遷移指數(shù)（FMI┴）應(yīng)是在0點(diǎn)左右。而與趨化物平行方向的化學(xué)趨化的遷移指數(shù)（FMI‖）與0點(diǎn)有顯著的區(qū)別表現(xiàn)出了化學(xué)趨向性。同時(shí)，使用Rayleigh Test**對(duì)細(xì)胞趨化的方向性進(jìn)行檢驗(yàn)。如果p值大于0.05表示了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的無序性，表明沒有方向性的遷移。此外，遷移速率等參數(shù)也能直接用于分析。

*Foxman et al. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation, J Cell Biol 147, 577-588 (1999)  

**Fisher, N. I. Statistical Analysis of Circular Data, Cambridge University Press, New York (1993) 

五、統(tǒng)計(jì)結(jié)果：

六、實(shí)驗(yàn)優(yōu)勢(shì)總結(jié)

1.可實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞趨化情況；

2.可計(jì)算細(xì)胞的趨化速率；

3.在1組實(shí)驗(yàn)中即可做出連續(xù)性趨化濃度梯度；

4.建立的濃度梯度可維持長(zhǎng)達(dá)48小時(shí)，對(duì)快速遷移細(xì)胞或慢速遷移細(xì)胞都適用；

5.可選配套的圖像分析，輕松得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。