投稿人：郭曉沖 中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部

寫給看文獻(xiàn)的你們：

我在這里想寫一些看文獻(xiàn)時(shí)可能遇到的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物知識(shí)，希望對(duì)大家有幫助。為了便于理解，語言偏通俗，可能不夠嚴(yán)謹(jǐn)。如果大家希望深入了解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專業(yè)知識(shí)，歡迎選修實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。

第一集，關(guān)于基因敲除小鼠。

基因敲除小鼠（Knockout Mice），人們使用復(fù)雜的方法使小鼠體內(nèi)的某一個(gè)基因不表達(dá)，從而使小鼠呈現(xiàn)這個(gè)基因缺失的狀態(tài)，可用于研究這個(gè)基因的功能。

但如果某個(gè)基因功能特別重要，這個(gè)基因缺失可能具有胚胎致死性，那我們就無法得到這種基因敲除的小鼠了，于是人們發(fā)明了條件性基因敲除技術(shù)。這一技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)在特定的時(shí)間、特定的細(xì)胞或組織內(nèi)使某個(gè)基因沉默。方法是首先在目的基因（就是打算敲除的那個(gè)基因）的兩側(cè)分別插入一段名為LoxP的DNA序列（LoxP序列是一段34bp的DNA序列，兩端的13個(gè)堿基為回文序列，中間的8個(gè)堿基決定LoxP的方向。具體序列如下：5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3'

3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5'）。然后我們需要用到一種帶有Cre酶的轉(zhuǎn)基因小鼠了。

下面分別解釋一下轉(zhuǎn)基因小鼠和Cre酶。

轉(zhuǎn)基因小鼠（Transgenic Mice），使用分子生物學(xué)方法使小鼠表達(dá)了一種小鼠本來沒有的基因，這個(gè)基因是人為插入的，可能是人的，大鼠的或者其他物種的。這個(gè)星球上第一只轉(zhuǎn)基因小鼠就表達(dá)了大鼠的生長素（growth hormone）基因，于是那只小鼠長到了大鼠的體型。

Cre酶是在噬菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種酶，它能特異性的識(shí)別LoxP序列，并把同方向排列的兩個(gè)LoxP序列之間的DNA切掉。前面說了，我們把LoxP序列放到了打算敲除基因的兩側(cè)，那么我們?nèi)绻�把Cre酶放到細(xì)胞核里，目的基因就被Cre酶切掉，從而實(shí)現(xiàn)目的基因敲除了。于是人們制作了能夠表達(dá)Cre酶的轉(zhuǎn)基因小鼠。把Cre轉(zhuǎn)基因小鼠和插入了LoxP序列的小鼠交配，就可以得到同時(shí)攜帶Cre和LoxP序列的小鼠了。當(dāng)Cre在細(xì)胞核內(nèi)遇見LoxP序列，目的基因就被敲除了。

想控制在哪個(gè)細(xì)胞或者什么時(shí)間敲除目的基因，只要控制Cre酶就可以了。制作Cre轉(zhuǎn)基因小鼠時(shí)在Cre酶前面放上特異性的啟動(dòng)子，那么Cre酶就在該啟動(dòng)子表達(dá)的細(xì)胞或組織內(nèi)表達(dá)，這樣就只有這個(gè)組織或細(xì)胞內(nèi)的目的基因被敲除。

時(shí)間上控制基因敲除的方法更為巧妙。人們修飾了Cre酶基因，修飾后的Cre基因可以轉(zhuǎn)錄為mRNA，也可以在核糖體上翻譯為蛋白質(zhì)。但是這種蛋白沒有穿過細(xì)胞核膜的能力，也就無法進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮切割DNA序列的功能。當(dāng)人們外源性給予藥物他莫昔芬（tamoxifen，縮寫TM，是雌激素類似物）后，修飾的Cre酶就會(huì)獲得穿過細(xì)胞核膜的能力。于是Cre進(jìn)入細(xì)胞核，與基因組相遇，切割掉LoxP之間的序列。于是人們實(shí)現(xiàn)了什么時(shí)候給藥，什么時(shí)間敲除基因（當(dāng)然得給Cre一點(diǎn)時(shí)間穿過細(xì)胞核膜）。需要注意的是，Cre是一種酶，那么和所有酶一樣，它的作用效果不會(huì)是百分之百的。也許100個(gè)細(xì)胞里表達(dá)了Cre，大約70個(gè)細(xì)胞內(nèi)的基因被敲除。

更多內(nèi)容：

Knockin mice，基因敲入小鼠。制作轉(zhuǎn)基因小鼠時(shí)，外源基因是隨機(jī)插入基因組的，具體插入哪個(gè)位置不一定�；�因敲入技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)把外源基因準(zhǔn)確的插入到指定位置，其原理、方法都和Knock out一樣，不過這里我們不講原理。最開始，人們使用Knockin技術(shù)是為了制備Cre小鼠，Cre被插入到ROSA26基因后面，因?yàn)镽OSA26是一個(gè)在所有細(xì)胞都表達(dá)的一個(gè)基因。Cre放在這個(gè)基因后面，可以得到全身表達(dá)Cre酶的小鼠。后來Knockin技術(shù)被更多方式的應(yīng)用，比如把綠色熒光蛋白（GFP）基因放在目的基因末尾，使目的基因與GFP融合表達(dá)，那么使用熒光顯微鏡觀察表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞即為表達(dá)目的基因的細(xì)胞，巧妙的發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)位置。