細(xì)胞凋亡檢測(cè)操作流程2--BrdU檢測(cè)凋亡細(xì)胞DNA斷裂片段

瀏覽次數(shù)：3045　發(fā)布日期：2015-12-30　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

凋亡檢測(cè)操作流程

二、 BrdU檢測(cè)凋亡細(xì)胞DNA斷裂片段

相關(guān)試劑及組分：

一步法: APO-DIRECT試劑盒（貨號(hào)：556381）：

PartA（4°C保存）	PartB（-20°C保存）
PI/RNase A Solution	FITC-dUTP
Reaction Buffer	TdT Enzyme
Rinsing Buffer	Negative Control Cells：已固定細(xì)胞
Wash Buffer	Positive Control Cells：已固定細(xì)胞

二步法: APO-BRDU™試劑盒（貨號(hào)：556405）：

PartA（4°C保存）	PartB（-20°C保存）
FITC-Labeled Anti-BrdU mAb	Br-dUTP
PI/Rnase staining buffer	Br-dUTP
Reaction Buffer	TdT Enzyme
Rinsing Buffer	Negative Control Cells：已固定細(xì)胞
Wash Buffer	Positive Control Cells：已固定細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)操作（適用于APO-DIRECT試劑盒）：

1. 細(xì)胞固定：
1) 用PBS洗細(xì)胞后，將細(xì)胞重懸于1%多聚甲醛的PBS溶液中，濃度為1-2x106/ml，冰浴30-60分鐘。

2) 300xg離心5分鐘，棄上清。

3) 用5ml PBS洗細(xì)胞兩次，重懸于70%乙醇中，濃度為1-2x106/ml，冰浴30-60分鐘。（70%乙醇

細(xì)胞懸液在-20°C放置12-18小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，得到的效果最好。細(xì)胞可以在-20°C保存幾

個(gè)月。）

2. 配制染色液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

3. 細(xì)胞染色：

1) 取離心管和Falcon試管，按標(biāo)本順序編號(hào)。

2) 取1x106細(xì)胞懸液加入離心管中，300xg離心5分鐘，棄去乙醇，留下沉積細(xì)胞。

質(zhì)控細(xì)胞（Negative Control Cells、Positive Control Cells）：混勻后取1ml（細(xì)胞數(shù)約 1x10^6/ml）加入離心管中，300xg離心5分鐘，棄去乙醇，留下沉積細(xì)胞。

3) 每管各加入1.0ml Wash Buffer，洗細(xì)胞兩遍，棄上清。

4) 加入DNA標(biāo)記液50μl重懸細(xì)胞。

5) 37°C溫育60分鐘（或者室溫過(guò)夜），每15分鐘搖勻一次。（非質(zhì)控細(xì)胞37°C溫育時(shí)間需根據(jù)不同情況有所凋整。）

6) 每管加入1.0ml Rinse Buffer，300xg離心5分鐘，棄上清。重復(fù)兩遍，棄去上清。

7) 加入0.5ml PI/RNase A Solution，混勻。若細(xì)胞濃度低，可將用量調(diào)整到0.3ml。

8) 室溫避光孵育30分鐘。

9) 3小時(shí)內(nèi)上流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果。

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