細胞周期流式檢測步驟詳解
材料與試劑：
| 全稱 | 簡稱 | 貨號 |
| PBS | —— | |
| 乙醇，70-80%,提前放置-20°C預(yù)冷 | 固定劑 | —— |
| BD Pharmingen™ stain buffer, or equivalent, 1X PBS, 2% FBS, 0.1% NaN3 (pH 7.1–7.4) |
染色液 | 554656 |
| BD Pharmingen™ PI/RNase staining buffer (for PI/Rnase staining) |
PI/RNase染色液 | 550825 |
| BD Pharmingen™ 7-AAD (7-Amino-Actinomycin D) staining solution (for 7-AAD staining) |
7-AAD染色液 | 559925 |
使用說明：
DNA染料，尤其是PI，具有較強的粘性。樣本上機檢測之后，應(yīng)遵照儀器說明書仔細清洗流式細胞儀，以免對下一位操作者結(jié)果造成影響 。
固定好的細胞可保存長達12個月 (儲存于70-80% 的乙醇，置于 -20°C保存).
操作步驟：
1. 收獲細胞于流式管中，加入3-4ml的PBS清洗細胞。
2. 1000rpm離心10分鐘，棄上清。
3. 逐滴加入5ml或更多預(yù)冷的70-80%的乙醇，渦旋混勻細胞， 4°C避光過夜（>18小時）。
4. 1000-1500rpm 離心細胞10分鐘，棄上清。之后清洗細胞2次以去除所有的乙醇。
注：第一次用1x PBS，第二次用染色液（貨號：554656）。
5. 細胞染色：每管樣本需10^6細胞。具體操作如下：
1) 對于PI/RNase 染色，將細胞重懸于0.5 mL PI/RNase 染色液（貨號：550825）。
2) 對于7-AAD染色，將細胞重懸于0.1 mL 染色液（貨號：554656），同時加入20 μL7-AAD染色液（貨號：559925）
6. 室溫避光孵育15分鐘。
7. 分析前4℃避光保存樣本。1小時之內(nèi)上流式細胞儀檢測。
樣本制備注意事項：
• 獲得單個細胞，盡量避免DNA的降解
• 樣本最關(guān)鍵的就是減少碎片（EDTA/不可過度吹打/離心rpm）
• PI既能與DNA結(jié)合，又能與RNA結(jié)合，所以要用RNase降解
• PI質(zhì)量及RNase所加量很重要，建議用商品化試劑
• 污染脫氧核糖核酸酶會降解DNA，故玻璃器皿和試劑要干凈滅菌
樣本檢測注意事項：
• 進樣速度：一般檢測細胞濃度調(diào)整為2E5–2E6/ml，進樣速度為低速。若峰形較寬，可能就是進樣速度太快
• 儀器質(zhì)控定期做，盡可能排除因機器設(shè)置引起的峰形加寬
• 排除粘連細胞（FL2-A/FL2-W）
• 通過電壓脈沖信號的寬度和面積區(qū)別實體組織標本中的粘連細胞群體，最大程度的減少粘連細胞帶來的假陽性結(jié)果
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