細(xì)胞Barcode技術(shù)使得不同本合并在一起進(jìn)行標(biāo)記、檢測、分析成為可能

在其他工作人員的幫助下，Zunder優(yōu)化了基于金屬標(biāo)簽的“細(xì)胞Barcorde”（Mass-tag cell barcording）技術(shù)�！凹�(xì)胞Barcorde”讓不同樣本的細(xì)胞帶上不同的金屬標(biāo)簽，使研究者可以將多個(gè)樣本混合為一管分析，簡化了樣本制備的操作的同時(shí)，也消除了由于染色和數(shù)據(jù)收集過程中產(chǎn)生的誤差。這樣做不僅節(jié)約了時(shí)間，也使研究者獲得更精確的數(shù)據(jù)，這一點(diǎn)在Zunder開展的這種大型實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目中顯得尤其重要。

當(dāng)時(shí)，Barcorde技術(shù)還沒有應(yīng)用于質(zhì)譜流式領(lǐng)域中，Zunder已經(jīng)豐富的熒光流式的Barcorde技術(shù)經(jīng)驗(yàn)。采用一種非冗余的二元編碼策略，使用鑭系金屬做為標(biāo)簽，他和同事Bodenmiller一起將這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于質(zhì)譜流式。

新的基于鈀元素元素的Barcorde方案

最近，Zunder對(duì)Protocol進(jìn)行改進(jìn)，利用鈀元素的六個(gè)沒有放射性的穩(wěn)定同位素實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本進(jìn)行Barcorde。新的Protocol采用了部分冗余的三元編碼方式，研究人員可以根據(jù)結(jié)果剔除不同樣本細(xì)胞間形成的二聚體。此外，它還配備有半自動(dòng)化的debarcorde算法，方便數(shù)據(jù)的分析。這些改進(jìn)不僅增加了可用的檢測通道，也改進(jìn)了數(shù)據(jù)的精確度，使研究者可以利用質(zhì)譜流式探索更多新的科學(xué)問題。

利用細(xì)胞Barcorde技術(shù)，Zunder利用一次實(shí)驗(yàn)就可以探索整個(gè)生物系統(tǒng)對(duì)多重刺激的反應(yīng)。他可以同時(shí)測量細(xì)胞重編程過程中近乎無限的數(shù)據(jù)點(diǎn)，檢測的參數(shù)包括細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)以及細(xì)胞表面Marker等。通過分析這些數(shù)據(jù)Zunder找到了重編程過程中可以做為“路標(biāo)”的蛋白分子，把這些“路標(biāo)”和其對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)相聯(lián)系，就能以空前的精細(xì)度展現(xiàn)細(xì)胞群體隨時(shí)間的變化。基于此，Zunder發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞重編程過程中一個(gè)重要的早期中間階段。

Zunder利用質(zhì)譜流式描繪的iPSC重編程“路線圖”

“Barcorde的方法非常有用，因?yàn)槲覀兛梢园言趯?shí)驗(yàn)中收集所有的樣品合并在一起檢測，” Zunder解釋說，“我們可以非常自信的說，在細(xì)胞群體中看到的任何變化，都不是樣本間的偶然誤差。這一點(diǎn)特別重要，尤其是對(duì)表達(dá)水平相差微小的樣本進(jìn)行分析的時(shí)候。”

上文提到的debarcode算法，是與Nolan實(shí)驗(yàn)室的同事Rache Finck合作開發(fā)的，這個(gè)算法可以將采集到的Barcorde數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)于原始樣品的獨(dú)立文件。半自動(dòng)化的算法提供了一個(gè)快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的解碼方法，讓研究人員繞過的繁瑣和主觀的手工設(shè)門過程。

在探索性實(shí)驗(yàn)中，研究人員需要將單細(xì)胞數(shù)據(jù)和細(xì)胞二聚體區(qū)分開來，這一點(diǎn)非常重要。Zunder要尋找的是細(xì)胞群體隨時(shí)間的發(fā)生的變化，他不想把一個(gè)細(xì)胞二聚體當(dāng)成一個(gè)沒有報(bào)道過的新細(xì)胞類型。哥倫比亞大學(xué)的Dana Pe’er提出了Hamming 編碼的想法，這啟發(fā)了Zunder，他對(duì)原來的技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，使用了冗余編碼體系，這可以幫助他非常容易的剔除近100%的二聚體數(shù)據(jù)。

細(xì)胞Barcorde技術(shù)可以很容易的整合到任何單細(xì)胞分析的工作流程�！拔覀冊诟杉�(xì)胞的研究中面臨的挑戰(zhàn)同樣適用于其他生物系統(tǒng)的研究，所以Cytof也可以在這些領(lǐng)域發(fā)揮類似的功能�！盳under注意到，“在復(fù)雜生物系統(tǒng)的研究中，可以測試的實(shí)驗(yàn)條件數(shù)量幾乎是無限的，你可以考慮不同的處理時(shí)間、不同的藥物濃度、不同的條件組合，通過對(duì)比，你可以掌握你所研究的生物系統(tǒng)究竟是如何運(yùn)作的�！睂①|(zhì)譜流式和細(xì)胞Barcorde技術(shù)相結(jié)合，使得研究者可以自由的獲得近乎無限的數(shù)據(jù)，極大的加快了研究進(jìn)程。

Barcorde技術(shù)的這些優(yōu)點(diǎn)使其在Zunder工作中不可或缺。“現(xiàn)在這已經(jīng)是標(biāo)準(zhǔn)的做法，”他說，“在我們的實(shí)驗(yàn)室，不論誰跑Cytof樣品，都會(huì)對(duì)樣本進(jìn)行barcorde�！�

在2015年初，Zunder和他的團(tuán)隊(duì)在Nature Protocols（Vol. 10, No. 2）雜志上分享這一技術(shù)。經(jīng)過斯坦福大學(xué)的授權(quán)，F(xiàn)luidigm公司進(jìn)行了大量的標(biāo)準(zhǔn)化和測試工作，推出了Zunder protocol的商業(yè)版本以及Barcorde試劑目錄，目前質(zhì)譜流式的客戶都可以方便的使用。

細(xì)胞Barcorde和數(shù)據(jù)的Debarcorde已經(jīng)成為CyTOF實(shí)驗(yàn)流程的重要組成部分